[发明专利]表达大熊猫犬瘟热病毒H、F基因重组山羊痘病毒的疫苗、其制备方法及免疫应用方法

说明书

本发明公开了一种表达大熊猫犬瘟热病毒H和F基因重组山羊痘病毒的疫苗，疫苗中含有以山羊痘病毒为载体，分别转染表达大熊猫犬瘟热病毒H或F基因的重组转移载体质粒pTK‑H‑Eg或pTK‑F‑Eg而获得的重组山羊痘病毒vpTK‑H‑Eg或vpTK‑F‑Eg，其中重组山羊痘病毒vpTK‑H‑Eg包含如序列表SEQ ID NO.1所示的核酸序列，重组山羊痘病毒vpTK‑F‑Eg包含如序列表SEQ ID NO.2所示的核酸序列。本发明所研制的疫苗具有安全、高效、生产成本低廉等优点，为犬瘟热的防制奠定基础。

技术领域

本发明涉及重组病毒技术领域，尤其涉及表达大熊猫犬瘟热病毒H、F基因重组山羊痘病毒的构建技术领域。

背景技术

犬瘟热(Canine Distemper,CD)是由犬瘟热病毒(Canine Distemper Virus,CDV)引起的是一种急性、高度接触性传染病。CDV是负链单股不分节的RNA，属于副黏病毒科、麻疹病毒属成员，经常引起犬科、鼬科、浣熊科及猫科等多种动物发病，发病率几乎可以达到100％，其临床症状多样，极易继发细菌、病毒感染或二次感染经济损失惨重，死亡率可高达80％，素有“毁灭性传染病”之称。近年来，CD的宿主范围不断地扩大，己经延伸到大熊猫、日本猕猴和部分海洋哺乳动物，甚至人也有感染CDV的报道^[2]，Mee等从患Hagets病人的组织中检测出CDV核酸。CDV极有可能成为第二种由犬感染人的病毒，因此引起了动物学界和医学界的密切关注。CDV对大熊猫、小熊猫也具高度感染性，已成为威胁大熊猫、小熊猫种群数量和生命安全的第一大烈性传染病。

犬瘟热病毒为有囊膜的单股、负链、不分节段的RNA病毒,全长15,616个核苷酸，从3’到5’依次为3’前导序列、核蛋白基因(N)、磷蛋白基因(P)、基质蛋白基因(M)、融合蛋白基因(F)、附着或血凝蛋白基因(H)、大L蛋白基因(L)和5’导序列。最新研究表明CDV囊膜两个糖蛋白质(H，F)是宿主免疫系统的主要目的抗原，是产生中和抗体的重要抗原之一。H蛋白基因由1947个核糖核苷酸组成，位于病毒基因组的7053-8999nt处，是CDV与细胞受体结合的蛋白，决定了病毒的细胞嗜性，同时介导了机体内重要的抗病毒免疫应答。系统发生树分析表明在麻疹病毒属的所有结构蛋白中H蛋白是各种毒株变异性最高的基因。目前分析认为，CDV的基因型与地理位置有关。新分离的CDV H蛋白的变异可能是近来暴发CD的重要原因。F蛋白基因位于基因组的4845-7049nt处，F蛋白功能为直接与细胞膜作用，从而诱导细胞膜融合。融合序列在麻疹病毒属中是相当保守的，该序列可能与病毒间出现的交叉保护现象有关。F蛋白诱导的免疫反应能阻止病毒感染，并且在有病毒增殖的情况下抑制症状的发生。在麻疹病毒成员中，CDV，MV和RPV群特异性表位主要是在F蛋白上，为异型免疫的主要交叉抗原。此外，在犬瘟热病毒F蛋白上存在着两个重要的辅助性T淋巴细胞表位，此辅助性T细胞表位可能是犬抗原提呈细胞(APCs)最优先识别和提呈的位点。因此，H、F蛋白在犬瘟热的免疫预防起着重要作用。

目前，预防CD的疫苗包括灭活苗、MV异型免疫疫苗、弱毒疫苗。虽然灭活苗和弱毒疫苗在控制犬瘟热上有一定作用，但随着使用的广泛，也出现了很多不足，灭活苗免疫效果低、抗体水平低等缺点；MV疫苗不能提供持久的免疫力；目前，主要使用弱毒苗，弱毒苗可引起免疫抑制和中枢神经系统的损坏，随着犬瘟热病毒宿主谱日趋扩大，弱毒疫苗可能会导致某些易感动物致死并带来毒力返强的危险，受母源抗体影响等。此外，病毒自身的变异也可能导致疫病的流行，因此研制出持久高效的、安全的、实用的新型疫苗疫苗迫在眉切，重组活载体疫苗是近年来研究比较热的新型疫苗，在犬瘟热的免疫与防方面取得很大进展。