[发明专利]表达大熊猫犬瘟热病毒H、F基因重组山羊痘病毒的疫苗、其制备方法及免疫应用方法

权利要求书

1.一种表达大熊猫犬瘟热病毒H和F基因重组山羊痘病毒的疫苗，其特征在于疫苗中含有以山羊痘病毒为载体，转染表达大熊猫犬瘟热病毒H和F基因的重组转移载体质粒pTK-H-Eg和pTK-F-Eg，获得重组山羊痘病毒vpTK-H-Eg和vpTK-F-Eg的质粒，其中重组山羊痘病毒vpTK-H-Eg的核酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，重组山羊痘病毒vpTK-F-Eg的核酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：大熊猫犬瘟热病毒H基因的核酸序列如SEQID NO.3所示，大熊猫犬瘟热病毒F基因的核酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.一种制备如权利要求1或2任一所述的疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)扩增出大熊猫犬瘟热病毒H基因序列和F基因序列，对其抗原保守结构和识别区域进行修饰，克隆入PUC57载体获得含H、F基因的PUC57-H，PUC57-F载体，PUC57-H的核酸序列如SEQ ID NO.3所示，PUC57-F的核酸序列如SEQ ID NO.4所示；

(2)构建转移载体骨架pMDTK-pEL:首先用限制性内切酶EcoR I消化pMDTK-PEL-EGFP，回收大片段再补平，接着用限制性内切酶Sma I消化，回收3480bp的pMDTK-PEL片段，然后用T4连接酶连接，使其自身环化，获得转移载体质粒pMDTK-PEL，将其转化到DH5a，测序正确，转移载体质粒命名为pMDTK-PEL；

(3)构建重组转移载体质粒pMDTK-PELH与pMDTK-PELF:

用BamHI与NotI内切酶消化pMDTK-PEL获得线性载体，回收大片段；同时用BamHI与NotI内切酶消化PUC57-H，回收小片段目的基因；将回收的目的基因与载体通过T4 DNA连接酶连接，然后转化，摇菌，经菌液PCR、双酶切、测序鉴定正确，命名为pMDTK-PELH；

用BamHI与NotI内切酶消化pMDTK-PEL获得载体，回收大片段；同时用BamHI与NotI内切酶消化PUC57-F,回收小片段目的基因；将回收的目的基因与载体通过T4 DNA连接酶连接，然后转化，摇菌，经菌液PCR、双酶切、测序鉴定正确，命名为pMDTK-PELF；

(4)构建转移载体质粒pTK-H-Eg和pTK-F-Eg:

用限制性内切酶Sal I分别消化pMDTK-PELH及pMDTK-PELF,用补平酶Klenow Fragment消化回收的pMDTK-PELH与pMDTK-PELF，用限制性内切酶Sac I消化重组转移载体质粒pMDTK-PELH与pMDTK-PELF补平后的回收产物，获得转移载体质粒pTK-H-Eg和pTK-F-Eg，其核酸序列分别如序列表SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2所示；

(5)制备及培养原代犊牛睾丸细胞并使用于GTPV AV41的增殖；

(6)制备重组GTPV,将步骤(4)获得的转移载体质粒pTK-H-Eg和pTK-F-Eg接毒感染GTPVAV41,筛选并纯化，获得重组病毒vpTK-H-Eg和vpTK-F-Eg。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(2)包括：

1)用限制性内切酶EcoR I消化pMDTK-PEL-EGFP，回收大片断；

2)用补平酶Klenow Fragment消化所回收的大片断；

3)用限制性内切酶Sam I消化步骤2)中的产物并回收3480bp的pMDTK-pEL片断；

4)采用T4 DNA连接酶使pMDTK-PEL自身环化连接；

5)制备DH5α感受态细胞；

6)步骤4)所得到的环化连接产物转化DH5α感受态细胞，经培养得到重组的转移载体骨架pMDTK-PEL。