[发明专利]一种检测待测样品与GPR40结合能力的方法及其专用特异荧光探针

说明书

本发明公开了一种检测待测样品与GPR40结合能力的方法及其特异荧光探针。所述特异荧光探针为式(Ⅱ)所示的化合物；R为产生荧光检测信号的无机基团或有机基团。实验证明，本发明提供的检测待测样品与GPR40结合能力的方法可检测待测样品与GPR40结合能力。利用本发明提供的方法检测待测样品与GPR40结合能力具有结合位点明确、特异性好、操作简单、所述特异荧光探针稳定性好且无危害性等优点。本发明提供的方法在检测待测样品与GPR40结合能力方面重要应用价值。

技术领域

本发明属于生物分析领域，具体涉及一种检测待测样品与GPR40结合能力的方法及其专用特异荧光探针。

背景技术

G蛋白偶联受体40(G protein-coupled receptor 40，GPR40)，又称为游离脂肪酸受体1(Free fatty acid receptor 1，FFAR1)，是一种具有7个跨膜α螺旋结构的G蛋白偶联受体。研究发现，GPR40在调节胰岛素分泌中发挥重要作用，如在胰岛β细胞中，GPR40可被游离脂肪酸激活，促使细胞内钙离子浓度升高，进而促进胰岛素释放。因此，以GPR40作为治疗糖尿病的药物靶标分子是当前国内外研究的热点，已有大量的研究工作致力于筛选能够作用于GPR40的药物，但是能够用于定量检测化合物与GPR40直接结合能力的方法则比较少。

Duncan等通过检测GPR40调控的细胞内钙离子浓度上升研究化合物与GPR40的结合作用，但是该方法只能间接的反应化合物能够作用于GPR40，并不能给出化合物与GPR40的直接结合能力，且在实验操作过程中，存在很多因素都会导致细胞的钙离子浓度变化。简单的通过钙离子浓度的变化反应化合物与受体的作用可能会造成假阳性的结果。此外，对于某些GPR40的抑制剂，其能够与受体结合，但并不会导致细胞内钙离子变化。因此，通过钙离子浓度的变化研究某些具有抑制作用的化合物与GPR40受体的作用时，可能会造成假阴性的结果。Lin等通过对GPR40已知的配体AMG837和AM1638进行放射性标记，得到了放射性探针[³H]AMG 837和放射性探针[³H]AM1638。Hauge等通过对GPR40的配体L358进行放射性标记得到了[³H]L358。放射性标记探针方法的优点是灵敏度很高，但是放射性探针危害较大，操作复杂，对操作人员技术要求高，难以推广使用。Hara等证明一种荧光分子标记的脂肪酸(C1-BODIPY-C12)可以作为检测化合物与GPR40结合能力的荧光探针。荧光探针相对放射性探针没有危害性，但该方法也需要将GPR40蛋白从细胞膜上分离提取，容易造成受体蛋白失活，同时需要采用免疫反应将GPR40固定到磁珠上，操作比较复杂。上述研究人员开发的放射性探针和荧光探针虽然能够与GPR40结合，但是在GPR40上的结合位点是未知的，因此，研究化合物与GPR40结合作用时，其在GPR40上的结合位点也是不明确的，难以对化合物的作用效果和作用机理进行深入研究。可见，设计针对GPR40的特异性探针，建立定性定量的检测化合物与GPR40结合能力的方法，对有效的筛选和研究化合物与GPR40的结合与效应具有重要意义。

Srivastava等(Srivastava et al.Nature，2014，513:124-139)通过蛋白晶体结构得到GPR40与TAK-875形成复合物的晶体结构，这是目前唯一解析的GPR40与配体的复合物晶体结构。晶体结构的结果明确的给出TAK-875在GPR40的特异性结合口袋位置。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何检测待测样品与GPR40结合能力。

为解决上述问题，本发明首先提供了特异荧光探针在检测待测样品与GPR40结合能力中的应用；所述GPR40为G蛋白偶联受体40；所述特异荧光探针为式(Ⅱ)所示的化合物；

R为产生荧光检测信号的无机基团或有机基团。

上述应用中，所述GPR40可为如下a1)或a2)或a3)：