[发明专利]一种检测致病性犬钩端螺旋体的荧光PCR引物、探针及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及检测引物与试剂盒，具体地说，涉及检测致病性犬 钩端螺旋体的荧光PCR引物、探针及试剂盒。

背景技术

钩端螺旋体病(Leptospirosis)是一种在全世界范围传播的人畜 共患疾病，简称钩体病，该病尤其广泛存在于发展中国家和热带地 区。犬对该病易感，感染后临床表现多样，不易进行诊断。钩体病 的病原体会持续存在于宿主机体内，会进一步扩散污染环境，感染 其他人和动物，危害严重。因而，犬患该病后，在危害其本身的健 康的同时，还会威胁到其主人的安全。因此，需要在早期对该病作 出诊断，尽早控制该病。目前，诊断犬钩体病的方法有直接镜检、 分离培养、血清学检测、动物接种等实验室检测方法，与这些方法 相比，PCR方法更省时省力，特异性和敏感性优异，并且可用于钩 体病的早期诊断。

公开号为CN103205502A的中国专利申请公开了一种检测狗钩端 螺旋体核酸的荧光定量PCR的引物、探针及试剂盒，所述引物针对致 病性狗钩端螺旋体的LigA基因序列设计。然而，在众多钩体的血清型 中，其中黄疸出血56601型没有LigA基因，而黄疸出血56601型会引起 钩端螺旋体病。因此上述技术方案无法对致病性狗钩端螺旋体进行全 面检测。

公开号为CN101935696A的中国专利申请公开了一种检测犬猫钩 端螺旋体的荧光定量PCR方法及其引物和检测试剂盒，其采用16s rRNA基因序列为设计引物。然而，致病性和非致病性钩体均含有16s rRNA基因，上述技术方案通过检测16srRNA基因来检测犬猫钩端螺 旋体，不能准确鉴别检测致病性和非致病性钩体。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种省时 省力，特异性和敏感性优异，检测犬钩端螺旋体LigB基因的PCR引物 及试剂盒，可用于犬钩端螺旋体病的早期诊断。

本发明原理在于选择了犬钩端螺旋体LigB基因作为检测对象，并 针对犬钩端螺旋体LigB基因特殊设计了引物，使引物具有优异的特异 性和敏感性。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供一种检测致病性犬钩端螺旋体的PCR引物，所述引 物如下：

上游引物：5’-CTTGGGATTCTTCTAATMCSGATA-3’；

下游引物：5’-GATCCTTGTATTCCACCGATG-3’；

所述探针为：

5'-FAM-AGCCACGGRTTAGCTTCCACACTCA-BHQ1-3'。

本发明还提供了所述引物与探针在制备检测致病性犬钩端螺旋 体的试剂盒方面的应用。

由于所述引物的扩增片段能够证明犬钩端螺旋体LigB基因的存 在，从而证明致病性犬钩端螺旋体的存在，因此，所述引物可用来制 备检测致病性犬钩端螺旋体的试剂盒。

在所述引物的存在下，加入配合使用的所述探针，能都在荧光 PCR仪上进行荧光定量PCR的检测。

基于上述原因，本发明还提供了含有所述引物与探针的试剂或试 剂盒。

具体为一种检测致病性犬钩端螺旋体的试剂盒，所述试剂盒包 括前述引物和探针、阳性对照、阴性对照、Taq酶、dNTP、10×Buffer、 ddH₂O。

进一步地，所述阳性对照的构建方法为：

1)以黄疸出血56601的基因组DNA作为模板，利用权利要求1所 述的引物进行PCR扩增，对PCR产物进行纯化回收，与pMD18-T进行 连接；

2)向Trans1-T1克隆感受态中加入步骤1)获得的连接产物，筛选 阳性克隆，提取质粒。

黄疸出血56601购自中国药品生物制品检定所钩端螺旋体实验 室，保藏编号为56601。

为了更好的实现对致病性犬钩端螺旋体的检测，本发明优化了所 述试剂盒的工作程序(尤其是退火温度)，使所述引物能够最大程度 地增加反应成功率和反应效果。

优化得到的工作程序为：

94℃3min；94℃20s，58℃50s，读板，35个循环。