[发明专利]一种添加前体物天冬氨酸提高石杉碱甲含量的蛇足石杉离体叶状体的培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用前体物天冬氨酸提高石杉碱甲含量的蛇足石杉离体叶状体的培养方法，即离体培养蛇足石杉叶状体添加天冬氨酸提高有用成分石杉碱甲累积量的培养方法，属于植物生物技术领域。

背景技术

蛇足石杉Huperzia serrate,又名千层塔，石杉科Huperziaceae,石杉属Huperzia，是一种矮小的多年生蕨类植物，有清热解毒，生肌止血，散瘀消肿功效。自1972年国内首次报道该植物中的生物碱--石杉碱甲(hupenine A,Hup-A)具有横纹肌松驰作用，以后深入研究发现该生物碱是一种强效、可逆和高选择性乙酰胆碱酯酶抑制剂。在低剂量Hup-A下对改善记忆力，治疗中老年痴呆及重症肌肉无力具有良好的疗效且副作用小。自然状态下，蛇足石杉生长缓慢，孢子需要15年才能萌发，加之长期掠夺式地采挖，野生蛇足石杉锐减；此外，人工大量栽培蛇足石杉难度较大，人工合成难以得到高光学活性的石杉碱甲，导致石杉碱甲价格昂贵，每公斤在世界市场上高达五十万美元。

自2012年本发明人离体培养蛇足石杉叶状体成功以来，深入广泛研究，发明了“一种产石杉碱甲的离体蛇足石杉叶状体诱导和培养方法”和“一种产石杉碱甲的激素自养型蛇足石杉离体叶状体克隆系”；本发明人系论文作者近年还报道了“蛇足石杉离体叶状体是产生石杉碱甲的最好形态”，和“叶状体具有累积与原植物相同的有效成分石杉碱甲的能力”。在上述专利和研究的基础上又发明了“一种添加前体物天冬氨酸提高石杉碱甲含量的蛇足石杉离体叶状体的培养方法”，利用本发明应用于大规模离体培养，可获得植物源的蛇足石杉叶状体转化的有用成分石杉碱甲，将产生及其重大的经济价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种添加前体物天冬氨酸提高石杉碱甲含量的蛇足石杉离体叶状体的培养方法。它解决了蛇足石杉野生资源匮乏、蛇足石杉野生植株及其离体培养物叶状体合成石杉碱甲含量较低的严重问题，这个问题阻碍了石杉碱甲药物剂型研发和社会运用。因此，本发明突破了利用生物技术开发植物源石杉碱甲再生新途径的一项重大技术难关。

本发明是这样实现的，所述方法步骤如下：

(1)所用材料：材料为本发明人离体建立的蛇足石杉叶状体培养物，该材料制备方法已申请专利(专利号ZL201210005499.6,专利名称“一种产石杉碱甲的离体蛇足石杉叶状体诱导和增殖的培养方法”)和“蛇足石杉离体培养产生石杉碱甲研究”论文报道，上述专利的发明人和论文作者均为本专利的发明人；

(2)叶状体培养物分割：在无菌条件下，将离体繁殖的叶状体组织块分割成0.05--0.1克鲜重的小块备用；

(3)将分割好的叶状体小块接种到培养蛇足石杉叶状体的基本培养基培养瓶中，每瓶接种4小块，置于培养箱中培养；

(4)接种的叶状体培养30—40天时，在无菌条件下，用一次性注射器取已灭菌的前体物天冬氨酸0.25m mol/L—1m mol/L的溶液5毫升添加到叶状体培养瓶中，继续培养40—50天，收获叶状体培养物；

(5)收获的叶状体于50℃温度的烘箱中烘干至恒重，研磨成粉末，用于制备石杉碱甲提取物，以高效液相色谱法检测提取物的石杉碱甲含量(ug/g)；

所述培养基按下列成分组成配制和处理：

分割的蛇足石杉叶状体接种的基本培养基：1/4MS+蔗糖25％+琼脂粉0.6％；培养基pH5.8-6.0，将培养基在0.1MPa高温高压下灭菌25min处理后使用。分割的蛇足石杉叶状体先接种在基本培养基中生长30—40天，随后再向培养瓶中添加无菌的前体物--天冬氨酸0.25mmol/L—1m mol/L溶液，每50ml基本培养基的叶状体培养瓶中添加5ml前体物--天冬氨酸溶液，组成叶状体生产石杉碱甲的培养基；

所述培养条件如下：

培养参数：培养箱恒温23±2℃，相对湿度50％-70％，光照强度为1700lx,日照时长15h/d。

本发明的技术效果是：蛇足石杉离体培养叶状体再生仅发明人有成功报道和授权专利(ZL2012100005499.6)鉴于蛇足石杉离体培养是开发生产原植物源药用石杉碱甲(Hup-A)资源的重要技术，本发明添加前体物最适浓度天冬氨酸培养的蛇足石杉离体叶状体可使石杉碱甲含量达97.5ug/g以上，比加水对照的石杉碱甲含量76.3ug/g提高了27.8％以上。利用本发明的方法进行蛇足石杉离体培养，可获得大量蛇足石杉叶状体药用植物资源，将该项技术扩大规模离体培养叶状体提取生产的药物石杉碱甲(Hup-A)将产生极为重大的经济价值。

附图说明