[发明专利]一种基于Mo P113蛋白的间接ELISA试剂盒及使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于MoP113蛋白的间接ELISA试剂盒及使用方法。

背景技术

绵羊肺炎支原体是致山羊和绵羊发生慢性呼吸道传染疾病及影响养羊业发展的重要疫病的主要病原菌之一，常危害1~3月龄羔羊，羊群感染后表现呼吸障碍、流鼻涕、渐进性消瘦、生长发育迟缓及间质性肺炎等慢性非典型性肺炎症状（EnginBalikci，2008）。1963年Mackay等首次在绵羊体内分离得到绵羊肺炎支原体，随后Cottew从患肺炎的澳大利亚绵羊体内分离到相同的病原菌，Carmicheal分离到具有致病性的这种新型支原体，且命名为绵羊肺炎支原体（MackayJMK,1963；GS.Cottew,971；CarmichaelLE,1972）。1978年我国首次从由新西兰等地引进的种羊体内分离到此病原，此后在我国贵州、云南、甘肃、湖南等多个省市都有此病报道(胡景韶，1982；李嫒，2007)。绵羊肺炎支原体引发的早期支原体肺炎病例患病率高、死亡率低，长时间以来未曾引起人们的重视，但近年调查发现，该病死亡率呈不断上升趋势，给养羊业带来严重的经济损失(张双翔，2013)。

对绵羊肺炎支原体的防控，目前主要依靠药物预防，尚缺乏可靠的疫苗，究其原因与Mo分离培养费时费力及基因组研究缓慢有关（候相山等，2006；赵萍等，2008）。临床疫苗（羊传染性胸膜肺炎灭活疫苗）应用也显示对Mo感染流行病例疫苗免疫防控效果不佳，给养羊业带来严重的经济损失（张双翔，2012）。且目前缺乏疫病检测与防控所需的快速血清学检测手段，尤其可高通量检测、敏感性高的ELISA方法。MoP113蛋白是一种重要的黏附分子和膜表面免疫原，黏附分子与病原致病力具有相关性，可作为亚单位疫苗及血清学诊断技术研究的靶蛋白（张亚宁，2013；SimionattoS，2012；张悦，2013；韦艳娜，2013）。而P113蛋白较大，全基因表达易形成包涵体，影响表达效率，选用其相对稳定C末端基因可有效检测该蛋白的抗原性等特征。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，选取核苷酸同源性较高的Mo贵州分离株株，通过MoP113基因原核表达载体的构建与表达，建立基于表达产物MoP113蛋白的间接ELISA方法，并进行条件优化，制备成商品化间接ELISA试剂盒。该间接ELISA试剂盒的发明，将为Mo引起的山羊和绵羊间质性肺炎疫病的早期监测、免疫效果评价提供关键技术，对本病原所致疫病的早发现早防控具有重要意义。

本发明的技术方案为：一种基于MoP113蛋白的间接ELISA试剂盒，间接ELISA试剂盒的原料配方为：包被酶标板1~5个，Mo标准阳性血清0.5-1.5mL、Mo标准阴性血清0.5-1.5mL、酶标二抗300~500μL、50×PBST缓冲液20~25mL、底物液A10mL~15mL、底物液B10mL~15mL和终止液10mL~15mL。

包被酶标板为重组蛋白包被，重组蛋白为MoP113基因通过大肠杆菌Rosseta（DE3）表达系统获得P113重组蛋白，并通过镍柱法蛋白纯化试剂盒进行重组蛋白纯化，使用包被缓冲液稀释为1.5μg~3.5μg/100μL，室温包被酶标板12h。3g/100mL的BSA溶液，37℃封闭ELISA反应板1.5h后即为包被酶标板。

Mo标准阳性血清应用绵羊肺炎支原体GZ-QX1株免疫山羊获得的高免血清，按1:100稀释。

Mo标准阴性血清为采集自Mo血清抗体阴性的山羊血清，按1:100稀释。

所述酶标二抗为兔抗羊IgG-HRP，按1:2000稀释使用。

所述50×PBST缓冲液为：NaCl400.0g、KCl10.0g、KH2PO410.0g、Na2HPO4·12H2O145g、Tween-2025mL溶于400~500mL蒸馏水，调整pH为7.2～7.6，定容至1000mL。

所述底物液A为Na2HPO414.60g、柠檬酸9.33g、过氧化氢脲0.52g，溶于三蒸水，并定容至1000mL，调至pH5.0～5.4。所述底物液B为TMB20mg、无水乙醇8~10mL，加双蒸水至1000mL，过滤除菌，无菌分装。

所述终止液为0.2%～0.3%HF溶液。

一种基于MoP113蛋白的间接ELISA试剂盒的使用方法，包含以下步骤：

第一，取包被酶标板，应用PBST洗涤ELISA反应板5次；