[发明专利]一种使用耐热重组HNH型核酸内切酶切割DNA的方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及基因工程技术，具体涉及构建能够过量表达耐热HNH 型核酸内切酶的基因工程菌、并将其应用在高温条件下切割DNA的方法。

背景技术

核酸酶是一类水解核酸磷酸二酯键的酶，存在几乎在所有的生物体中。核酸酶在遗传机 制的不同方面发挥重要的作用，例如避免突变、DNA修复、DNA复制和重组、为生长代谢清除 核苷和磷酸、宿主防御外源的核酸分子、病毒感染宿主的建立和细胞凋亡等。除此之外，核 酸酶还被广泛应用于分子生物学的各种研究中，例如核酸结构的检测、RNA的快速测序、蛋 白纯化中去除核酸以及抗病毒试剂的应用等。

根据核酸酶作用的方式，核酸酶可以分为核酸内切酶和核酸外切酶。核酸内切酶从核酸 的内部切开核酸，核酸外切酶从核酸的一端逐个切开核酸，作用时产生单核苷酸。此外，也 有少数既作用于链的内部又作用于链的外部的核酸酶，例如小球菌核酸酶。根据核酸酶作用 的底物，核酸酶可以分为RNA酶、DNA酶以及非特异性核酸酶。RNA酶只作用于RNA，DNA酶 只作用于DNA，非特异性核酸酶对RNA、DNA两者均可切割。

HNH(Histine-Asparagine-Histine，组氨酸-天冬酰胺-组氨酸)型核酸内切酶具有两个 高度保守的组氨酸(His)和一个高度保守的天冬酰胺(Asn)的结构域，该保守的结构域约 由35个氨基酸组成，如图1所示。HNH型核酸内切酶包括大肠菌素E7和E9、S1和S2脓菌素和一 些DNA限制性核酸内切酶，比如KpnI，PacI和Hpy99I。目前，关于源自于噬菌体HNH型核酸内 切酶的报道，多数是从常温菌中发现。这些源自常温菌的HNH型核酸内切酶只能在常温条件例 下切割DNA，不能在高温条件下发挥切割核酸的功能，使其应用受到了限制。现有技术中，关 于该高温噬菌体HNH型核酸内切酶的表达及应用，尚未有研究和报道。

GVE2(GeobacillusvirusE2)是从分离于自东太平洋深海热液区的嗜热菌Geobacillus sp.263分离出的一种高温噬菌体。GVE2能够生存在高温环境(例如：生长温度为60℃，Liu B,ZhangX.Deep-seathermophilicGeobacillusbacteriophageGVE2transcriptional profileandproteomiccharacterizationofvirions.ApplMicrobiolBiotechnol.2008 80(4):697-707)，是一个典型的Siphoviridae噬菌体，与λ噬菌体在形态上极其相似，但 其基因组序列和预测的蛋白质序列与λ噬菌体同源性很低。目前，GVE2基因组的测序已经 完成，其编码一种HNH型核酸内切酶。

发明内容

本发明的目的在于利用基因工程技术构建一株能够过量表达GVE2HNH型核酸内切酶的基 因工程菌，通过诱导表达、热处理和镍离子亲和柱纯化等步骤，制备出可以在温度高于60℃ 的条件下高效切割双链DNA的电泳级耐热重组酶蛋白，以便于在高温环境下有效切割DNA， 可以应用于如分子生物学、疫苗工业、蛋白和多糖类制药工业等涉及到核酸去除的催化领域。

为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：

本发明提供了一种使用耐热重组HNH型核酸内切酶切割DNA的方法，其特征在于，包括 以下步骤：

1)利用具有如下核苷酸序列的扩增引物，以GVE2基因组为模板进行PCR扩增：

正向引物为：5'-GGAATTCCATATGCCAAGCAAACCACTGCGACC-3'，

反向引物为：5'-CCGCTCGAGCCCATACCGTCGCTTATCTTCCG-3'；

2)对步骤1)中得到的PCR扩增产物和pET-30a载体进行NdeI和XhoI双酶切反应；

3)回收并纯化步骤2)中所得的酶切后的PCR产物和pET-30a载体片段后，进行酶基因 与载体的连接反应；

4)将步骤3)中所得的连接产物转化到感受态细胞中，随后涂布在含有卡那霉素的LB 平板进行培养后挑取克隆，并提取质粒进行测序验证；

5)将步骤4)中获得的基因序列正确的克隆质粒转化到感受态细胞中进行诱导表达；

6)从步骤5)中所获得的细胞中提取并纯化该GVE2HNH型耐热重组核酸内切酶；