[发明专利]一种使用耐热重组HNH型核酸内切酶切割DNA的方法

权利要求书

1.一种使用耐热重组HNH型核酸内切酶切割DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)利用具有如下核苷酸序列的扩增引物，以深海嗜热噬菌体GVE2基因组为模板进行PCR 扩增：

正向引物为：5'-GGAATTCCATATGCCAAGCAAACCACTGCGACC-3'，

反向引物为：5'-CCGCTCGAGCCCATACCGTCGCTTATCTTCCG-3'；

2)对步骤1)中得到的PCR扩增产物和pET-30a载体进行NdeI和XhoI双酶切反应；

3)回收并纯化步骤2)中所得的酶切后的PCR产物和pET-30a载体片段后，进行酶基因 与载体的连接反应；

4)将步骤3)中所得的连接产物转化到感受态细胞中，随后涂布在含有卡那霉素的LB 平板进行培养后挑取克隆，并提取质粒进行测序验证；

5)将步骤4)中获得的基因序列正确的克隆质粒转化到感受态细胞中进行诱导表达；

6)从步骤5)中所获得的细胞中提取并纯化该耐热重组核酸内切酶；

7)使用步骤6)中获得的GVE2HNH型核酸内切酶切割DNA：切割反应温度大于60℃，切 割反应pH值大于5.5。

2.如权利要求1所述的一种使用耐热重组HNH型核酸内切酶切割DNA的方法，其特征在于， 步骤7)中所述切割反应温度为60-70℃。

3.如权利要求1所述的一种使用耐热重组HNH型核酸内切酶切割DNA的方法，其特征在于， 步骤7)中所述切割反应pH值为大于7.5。

4.如权利要求1所述的一种使用耐热重组HNH型核酸内切酶切割DNA的方法，其特征在于， 步骤7)中所述切割反应中加入金属离子Fe²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Ni²⁺或者Co²⁺。

5.如权利要求1所述的一种使用耐热重组HNH型核酸内切酶切割DNA的方法，其特征在于， 步骤7)中所述切割反应中不使用盐。

6.如权利要求1所述的一种使用耐热重组HNH型核酸内切酶切割DNA的方法，其特征在于， 步骤7)中使用GVE2HNH型核酸内切酶切割DNA的反应体系为20μL：200ng质粒pET-30aDNA 或者λDNA、20mMTris–HClpH8.0、1mMDTT、100nMGVE2HNH型核酸内切酶、2mMMnCl₂、 0.1mg/mlBSA和10％甘油；切割反应时间为15分钟。

7.如权利要求1所述的一种使用耐热重组HNH型核酸内切酶切割DNA的方法，其特征在于， 步骤6)中所述的提取并纯化处理方法为对所述细胞进行超声波破碎、热处理和镍离子亲和 柱纯化。