[发明专利]一种沉默狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因VTP的dsRNA及其应用

说明书

技术领域：

本发明属于生物化学与分子生物学领域，具体涉及一种沉默狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因 VTP的dsRNA及其应用。

背景技术：

狄斯瓦螨Varroadestructor(Anderson&Trueman,2000)是危害世界养蜂业的重要外寄 生虫，给世界养蜂业及农业带来巨大损失(Martinetal.,2004)。狄斯瓦螨可危害蜜蜂封盖幼 虫、蛹和成蜂，同时携带并传播蜜蜂病毒，与梅氏热厉螨(Tropilaelapsmercedesae)共感染 (Luoetal.,2011)，从而造成蜂群生产力严重下降，乃至全群毁灭。狄斯瓦螨以蜜蜂的血淋 巴为食，成年雌螨在蜂蛹的表皮上打孔喂养它的子代，其唾液蛋白能够抑制血细胞凝集，阻 止蜜蜂的伤口愈合并减少相应的宿主反应(Richardsetal.,2011)。

本实验室从狄斯瓦螨唾液中分离纯化到一个对蜜蜂具有毒性的狄斯瓦螨唾液毒性蛋白 VTP，及其编码基因-狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因VTP的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种对狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因具有非常好的沉默效果的 dsRNA。

本发明的沉默狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因VTP的dsRNA，其特征在于，由SEQIDNO.1 所示的核苷酸序列和其反向互补序列所示的核苷酸序列组成的双链RNA。

本发明的第二个目的是提供上述dsRNA在沉默狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因VTP中的应 用。

一种沉默狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因VTP的制剂，其特征在于，含有上述dsRNA作为 有效成份。

本发明的第三个目的是提供上述dsRNA在狄斯瓦螨感染蜜蜂情况下提高蜜蜂存活率中 的应用。

一种防控蜜蜂受狄斯瓦螨感染下提高蜜蜂存活率的制剂，其特征在于，含有上述dsRNA 作为有效成份。

本发明通过实验发现，本发明的沉默狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因VTP的dsRNA能够沉 默狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因VTP，与对照相比浸泡在沉默狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因VTP 的dsRNA中的狄斯瓦螨，其体内狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因VTP的mRNA含量显著降低， 并持续到蜜蜂预蛹羽化，沉默了狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因VTP后的狄斯瓦螨毒性显著降低， 与对照相比，其侵染后意蜂的预蛹存活率明显提高，而中华蜜蜂预蛹的死亡率也显著降低。 因此可以将本发明的dsRNA沉默狄斯瓦螨的毒性蛋白基因，从而达到降低狄斯瓦螨对蜜蜂的 危害。

附图说明：

图1是沉默效果测定图，其中Vd-CK代表狄斯瓦螨没有经过任何处理；Vd-0.9％NaCl代表 狄斯瓦螨浸泡过质量分数0.9％NaCl溶液；Vd-dsGFP代表狄斯瓦螨浸泡过dsRNA-GFP； Vd-dsVTP表示蜜蜂被浸泡过dsRNA-VTP溶液的狄斯瓦螨侵染。

图2是沉默后狄斯瓦螨对蜜蜂的毒性检测图，图A是对意大利蜜蜂预蛹的测定，图B是对中 华蜜蜂预蛹的毒性测定，图中dsVTP表示狄斯瓦螨浸泡过dsRNA-VTP；dsGFP表示狄斯瓦螨 浸泡过dsRNA-GFP；0.9％NaCl表示狄斯瓦螨浸泡过质量分数0.9％NaCl溶液；Vd表示狄斯 瓦螨没有经过任何处理；NoVd：蜜蜂预蛹中没有加入瓦螨侵染的空白对照。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

1.狄斯瓦螨和蜜蜂的收集：狄斯瓦螨成年雌螨收集于意蜂工蜂房内，取出后放在内置9cm 滤纸的无菌培养皿中，备用。蜜蜂预蛹则置于垫有无菌滤纸的48孔培养板，每孔放1只 预蛹，备用。

2.狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因VTP的克隆

取狄斯瓦螨约60头，采用TriZolReagent(Invitrogen公司，其货号为：15596026)提取总 RNA，采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测总RNA的纯度及量，取1μg的总RNA做 起始逆转录反应，采用的逆转录试剂盒为SMARTer^TMRACEcDNAAmplificationKit(Clontech, 货号：634923)，逆转录反应的步骤参考该试剂盒的使用说明，获得逆转录产物。

以逆转录产物为模板，设计VTP基因的特异性引物：