[发明专利]一种表达载体

说明书

本发明属于生物技术领域，涉及一种表达载体，其含苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus AcMNPV)立即早期1启动子(AcIE1启动子)和同源区域5(homologous region 5)增强子(hr5增强子)及核多角体病病毒(Orgyia pseudotsugata multicapsid nuclear polyhedrosis virus，OpMNPV)立即早期2启动子(Opie2启动子)的昆虫表达载体，含此表达载体的昆虫宿主细胞以及用该表达载体制备重组蛋白的方法。

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种表达载体。

背景技术

一些培养的昆虫细胞系是各种研究应用以及作为疫苗的病毒类颗粒(VLP)的重组蛋白异源表达的重要宿主(Cherezov等，2007；Imasaki等人，2011；Rasmussen等人，2007；White等人，2012)，(Metz和Pijlman，2011；Shrestha等人，2007；Treanor等人，2011；Treanor等人，2011年)。这些工艺主要利用杆状病毒表达载体系统(BEVS)来感染源自鳞翅目的细胞系。(Berger等人，2004；Jarvis，2009；Kost等人，2005；Summers，2006)。最常用的宿主是来自于Spodoptera frugiperda的Sf21和Sf9以及来自Trichoplusia ni的BTI-TN-5B1-4细胞系(又称High Five或Tn-5)。这些细胞能在悬浮培养下生长到很高的细胞密度，并且能够执行翻译后的蛋白质修饰，包括N-和O-端糖基化(Kost等人，2005；贾维斯，2009)。当使用BEVS用于基因递送时，Tn-5细胞是生产分泌蛋白质的优选宿主(Drugmand等人，2012；Granados等人，1994)。

尽管BEVS的运用非常成功，其还是存在几个缺点。杆状病毒载体的生成将可能需要长达3个星期(Jarvis，2014年)。因为病毒引起的细胞裂解，蛋白生产阶段的持续时间被限制在约3-4天以内。分泌蛋白和细胞表面蛋白的通常产量往往小于10μg/mL，而细胞内蛋白质的产量已经有报道达到了100μg/mL(Harrison和Jarvis，2007；Jarvis，2009)。可以通过稳定转染昆虫细胞系来替代使用BEVS瞬时生产蛋白质的方法。但是，这种方法不仅费时，而且蛋白产量通常很低(Harrison和Jarvis，2007；Drugmand等人，2012)。

通常使用BEVS来构建表达载体是将目的基因人工连接于杆状病毒的晚期(late)和/或非常晚期(very late)启动子之后，利用其强力启动子，以期能表达较大量的目标蛋白。但该方法存在非常明显的缺陷，即通常在晚期(late)或非常晚期(very late)启动子开始表达之后，宿主细胞将在两三天内快速死亡，无法达到长期表达的目的。

发明内容

本发明目的之一在于提供一种能长时间稳定大量表达目的基因的表达载体。

本发明目的之二在于提供含上述表达载体的宿主细胞。

本发明目的之三在于提供一种利用上述载体制备重组蛋白的方法及其获得的蛋白。

发明通过以下技术方案实现：

首先，发明提供了一种表达载体，包含至少一个调控单元，所述调控单元含有：

a.hr_x增强子或其功能片段或序列变体；

b.AcIE_x启动子或其功能片段或序列变体；和

c.Opie_x启动子或其功能片段或序列变体。