[发明专利]一种用于特异性检测肠杆菌科细菌的引物、探针及其应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种特异性检测肠杆菌科细菌的引物、探针及其应用，并进一步公开了一种特异性检测肠杆菌科细菌的方法。

背景技术

肠杆菌科细菌隶属于细菌界，肠杆菌科包括无芽孢、周身鞭毛或无鞭毛的革兰氏染色阴性直杆菌，具有分布广的特点，其寄主范围大，人、动物、植物都有寄生或共生、附生、腐生，也可在土壤或水中生存，与人类关系密切。肠杆菌科细菌易于培养，繁殖快(在适宜条件下每20～30分钟可增殖一代)。

肠杆菌科细菌具有化能有机营养，兼营呼吸代谢和发酵代谢；可通过氧化多种简单有机化合物或发酵糖、有机酸或多元醇来获取能量；大部分能在含有一种碳源的无机氮培养基上生长；有些种生长时需要某种氨基酸或水溶性维生素；除个别血清型外，接触酶均为阳性，氧化酶阴性；除欧文氏菌属中的少数种外，均还原硝酸盐为亚硝酸盐；DNA(脱氧核糖核酸)中的G+C(鸟嘌呤和胞嘧啶)克分子含量为39～59％。

而阪崎肠杆菌，属于肠杆菌科，是寄生在人和动物肠道内的革兰氏阴性菌，无芽孢，周生鞭毛，能运动，其包括埃希氏菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、变形杆菌属、耶尔森氏菌属等属的菌体。阪崎肠杆菌可导致婴儿及早产儿脑膜炎、败血症和坏死性结肠炎，死亡率高达50％，已引起世界多国相关部门的重视。国家食源性疾病监测网自2007年起把阪崎肠杆菌列为婴儿配方食品重点监测病原菌。

目前大多数中国企业采用培养基筛选法检测婴儿配方食品中的阪崎肠杆菌，具体操作参照国标478940-2010，操作步骤如下：

(1)前增菌和增菌

取检样100g(mL)加入已预热至44℃装有900mL缓冲蛋白胨水的锥形瓶中，用手缓缓地摇动至充分溶解，36℃±1℃培养18h±2h。移取1mL转种于10mL mLST-Vm肉汤，44℃±0.5℃培养24h±2h。

(2)分离

2.1轻轻混匀mLST-Vm肉汤培养物，各取增菌培养物1环，分别划线接种于两个阪崎肠杆菌显色培养基平板，36℃±1℃培养24h±2h。

2.2挑取1个～5个可疑菌落，划线接种于胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)平板。25℃±1℃培养48h±4h。

(3)鉴定

自TSA平板上直接挑取黄色可疑菌落，进行生化鉴定。可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统。

上述培养基筛选法的缺点如下：

1、总的检测时间需5天左右，且需要接种大量不同的培养皿，费时费力。

2、需要大量培养基原材料，耗材等。

3、需要大量的空间放置这些培养皿以及需要大量的人力清洗培养皿。

除培养基筛选法以外还有荧光PCR方法的检测技术(中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1632.3-2005)。PCR全称是聚合酶链式反应。使用两段(20-24个核苷酸)寡核苷酸作为反应的引物，这两段寡核苷酸引物的序列不发生互补作用。但它们可以和成为模板的待测DNA两条链上的位点分别发生互补。反应液由包括含有镁离子的反应缓冲液，DNA聚合酶，4种单核苷酸(dNTP)，模板DNA以及引物组成。通过温度的变化(变性，退火，延伸)合成两个互补位点之间的DNA片段。这样的反应反复进行，使DNA片段得以扩增。经30左右个循环，扩增倍数达106。

而荧光PCR是在普通PCR基础上加入一条特异的寡核苷酸荧光探针，该探针5’端标记了FAM荧光素，3’端标记了TAMRA荧光素，此时FAM的荧光被TAMRA猝灭，仪器检测不到荧光。PCR延伸阶段，DNA聚合酶发挥其5’-3’外切核酸酶功能，将探针切割，与此同时标记在探针上的FAM游离出来，其所发出的荧光不再被TAMRA所猝灭而被仪器检测到。PCR过程中，每对目的片段进行一次有效的扩增，同时对探针进行了一次切割以及对FAM进行了一次检测。仪器检测到FAM的增量，可以间接的反映目的片段的扩增量。具体操作步骤如下：

(1)、取1mL增菌后的样品加到1.5mL无菌离心管中；

(2)、8000r/min离心5min，尽量去除上清液；

(3)、加50μLDNA提取液，充分混匀；

(4)、沸水浴5min；

(5)、12000r/min离心5min。上清液即可作为模板DNA进行荧光PCR扩增；