[发明专利]一种用于特异性检测肠杆菌科细菌的引物、探针及其应用

权利要求书

1.一种特异性检测肠杆菌科细菌的引物，其特征在于，所述引物的序列结构如下：

肠杆菌科-F：5′-CTG AAA GCA TCT AAG CAC GAA ACT TG-3′；

肠杆菌科-R：5′-GTC GTC TTC AAC GTT CCT TCA GG-3′；

内部阳性对照-F：5′-TGT GAA ATA CCG CAC AGA TG-3′；

内部阳性对照(IAC)-R：5′-AGC TGG CGT AAT AGC GAA G-3′。

2.一种用于特异性检测阪崎肠杆菌的探针，其特征在于，所述探针的序列结构如下：

肠杆菌科细菌探针：

5′-HEX-AGAGTAGTAGTTGTAGAGGCCGTGCTTCCGAAAG-BHQ-1-3′；内部阳性对照探针：

5′-ROX-TAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCC-BHQ-2-3′。

3.一种用于特异性检测肠杆菌科细菌的试剂盒，其特征在于：包括权利要求11所述的引物及权利要求12所述的探针，以及光敏感性物质。

4.根据权利要求3所述的用于特异性检测肠杆菌科细菌的试剂盒，其特征在于：所述光敏感性物质包括可与DNA的碱基形成共价键的溴化乙锭单叠氮溴(EMA)，其浓度为125μg/mL。

5.根据权利要求3或4所述的用于特异性检测肠杆菌科细菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：

内部阳性对照物，所述内部阳性对照物包括pUC19质粒DNA；

DNA聚合酶和尿嘧啶-DNA糖基化酶的混合物；

肠杆菌科细菌的DNA为阳性对照、PCR级水为阴性对照；

缓冲蛋白胨水和DNA提取液；

并选择性的添加可视化的黄色染料。

6.一种特异性检测肠杆菌科细菌的方法，其特征在于，采用如权利要求3-5中任意一项所述的试剂盒，该检测方法包括以下的步骤：

(1)DNA的提取：

取待检样品进行增殖培养、富集，向100μl富集液中加入300μl溴化乙锭单叠氮溴，然后室温暗室培养5min，之后在500W光下曝光5min，离心、除去上清液，再加入DNA提取液，充分混匀、培养、离心，取上清液作为模板DNA；

(2)PCR反应体系：

25μL的反应体系包括18μL所述引物和探针；1μL的所述DNA聚合酶和尿嘧啶-DNA糖基化酶的混合物；1μL内部阳性对照物；5μL模板DNA或阳性对照物或阴性对照物；

(3)PCR反应程序：

在37℃下4min，95℃预变性5min；95℃变性10s，65℃退火延伸70s，40个循环，同时收集FAM，HEX和ROX荧光信号；

(4)结合扩增曲线图判定实验结果。

7.一种用于特异性检测肠杆菌科及阪崎肠杆菌的试剂盒，其特征在于：包括：

阪崎肠杆菌-F：5′-AGG GGA TAT TGT CCC CTG AAA CAG-3′；

阪崎肠杆菌-R：5′-AAA CGA GAA TAA GCC GCG CAT T-3′；

肠杆菌科-F：5′-CTG AAA GCA TCT AAG CAC GAA ACT TG-3′；

肠杆菌科-R：5′-GTC GTC TTC AAC GTT CCT TCA GG-3′；

内部阳性对照-F：5′-TGT GAA ATA CCG CAC AGA TG-3′；

内部阳性对照(IAC)-R：5′-AGC TGG CGT AAT AGC GAA G-3′；

阪崎肠杆菌探针：

5′-HEX-AGAGTAGTAGTTGTAGAGGCCGTGCTTCCGAAAG-BHQ-1-3′；

肠杆菌科探针：

5′-HEX-AGAGTAGTAGTTGTAGAGGCCGTGCTTCCGAAAG-BHQ-1-3′；

内部阳性对照探针：

5′-ROX-TAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCC-BHQ-2-3′；

以及光敏感性物质。