[发明专利]一种提高农杆菌介导的玉米遗传转化效率的方法

权利要求书

1.一种提高农杆菌介导的玉米遗传转化效率的方法，其包括以下步骤：

第一步：挑选长势相似的已经授粉9天的玉米果穗，用含有5％有效氯的次氯酸钠溶液灭菌20分钟，每隔5分钟搅动一次；用无菌水冲洗2次后开始剥胚；其中，所述次氯酸钠溶液含有1-2滴tween 20；

第二步：挑选1.0-1.5mm的白色透明幼胚，装配到装有无菌inf侵染培养基的1.5mL离心管里；

第三步：用所述无菌inf侵染培养基清洗幼胚2-3次；

第四步：分别预热两管热激液，第一热激液预热温度为38℃，第二热激液预热温度为42℃，并准备冰浴条件；

第五步：吸干所述离心管里的无菌inf侵染培养基后，用已经预热好的38℃无菌的第一热激液加入离心管中，并将离心管立即放入38℃水浴热激8分钟；

第六步：随后立刻将带有幼胚的离心管放入冰浴中，冰浴3分钟后取出，重新加入无菌inf侵染培养基冲洗；

第七步：再次吸干离心管里的无菌inf侵染培养基后，将已经预热好的42℃无菌的第二热激液加入到离心管中，并立即放入42℃水浴热激1分30秒；

第八步：将水浴温度调至20℃，使含有幼胚的第二热激液自然降温至20℃后，吸干离心管中的液体；

第九步：在离心管中加入用无菌inf侵染培养基重悬后的OD550＝0.3的农杆菌菌液，在20℃条件下侵染20分钟后吸干所述菌液，盾片朝上将所述幼胚摆到共培养培养基上，共培养3天；

其中：

所述第一热激液包含1g/L的NH₄Cl、0.34g/L的MgSO₄、150mg/L的KCl、10mg/L的CaCl₂、3mg/L的FeSO₄、0.5mol/L的NaH₂PO₄、20g/L的蔗糖、19.52g/L的MES、200μmol/L的AS、100mg/L的SM；

所述第二热激液包含1/2N6salts、N6维生素、2.0mg/L的2,4-D、0.115g/L的脯氨酸、68.4g/L的蔗糖、36g/L的葡萄糖、0.5g/L的MES、0.1g/L的肌醇、100mM的AS；

所述无菌inf侵染培养基为pH 5.2，且包含：1/2N6salts、N6维生素、2.0mg/L的2,4-D、0.7g/L的脯氨酸、68.4g/L的蔗糖、36g/L的葡萄糖、0.5g/L的MES、0.1g/L的肌醇、100mM的AS；

所述共培养培养基pH为5.8，其包含：1/2N6salts、N6维生素、2.0mg/L的2,4-D、0.7g/L的脯氨酸、30g/L的蔗糖、0.5g/L的MES、0.1g/L的肌醇、0.154g/L的DDT、0.3g/L的半胱氨酸、0.85mg/L的硝酸银、100μM的AS、8g/L的琼脂；

所述玉米为Hi-Ⅱ玉米；

所述农杆菌为根癌农杆菌LBA4404。