[发明专利]检测牛ADIPOQ基因mRNA表达水平的特异性引物和荧光定量检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及检测牛ADIPOQ基因mRNA表达水平的特异性引物和荧光定量PCR检测试剂盒。

背景技术

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是DNA体外操作技术中最常用的技术。PCR技术将模板DNA、特异性引物、dNTPs底物、耐热DNA聚合酶、镁离子等放在同一个缓冲反应体系中，进行反复高温变性、低温退火、中温链延伸的热循环，实现靶DNA片段在反应液中呈2ⁿ倍扩增（其中n为热循环次数）。

荧光定量PCR技术是在普通PCR反应的基础上，结合了实时荧光检测技术和计算机分析技术。荧光定量PCR在普通PCR反应体系中加入特定的荧光标记物质，通过检测每个热循环后PCR反应体系中的荧光值的变化情况来实时监测DNA的扩增情况，并获得每个样本的荧光定量变化曲线，进而获得每个反应管的Ct值（荧光变化达到阈值时的循环数）；同时，在相同的反应体系和反应条件下检测2（或10）倍稀释的已知数量的靶标DNA，获得其Ct值，以起始模板数的对数为横坐标，以Ct值为纵坐标制备标准曲线，据此标准曲线和各个标本的Ct值对每个反应的起始DNA模板数进行定量测定。

虽然Northern blot技术可检测基因的mRNA表达水平，但整个实验过程操作比较复杂。Northern blot实验中一个主要的问题是存在RNA的降解，所以Northern Blot中所有的实验用品都需要经过除去RNA酶的过程，如高温烘烤、DEPC处理等。另外，Northern Blot中很多实验用品如甲醛、EB、DEPC、紫外灯等等对人体都有一定的伤害。基因芯片实验虽然降低了实验人员的工作量，并可以在一次实验中同时检测几千个基因表达量变化，但是其灵敏度较低。

而SYBR Green是一种结合于双链DNA小沟中的结合染料。与双链DNA结合后，其荧光大大增强。该性质用于扩增产物的检测非常理想。SYBR Green的最大吸收波长约为497 nm，发射波长最大约为520 nm。在 PCR 反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

SYBR Green在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链DNA相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好，且价格相对较低。此外，由于一个PCR产物可以与多分子的染料结合，因此SRYB Green的灵敏度很高。但是，由于SYRB Green与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响。由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析由SYBR Green得到定量结果。

脂联素（Adiponectin，ADIPOQ）主要由大量聚集成团的脂肪细胞构成，是脂肪细胞分泌的一种内源性生物活性多肽或蛋白质。ADIPOQ同时也是一种胰岛素增敏激素，能改善小鼠的胰岛素抗性和动脉硬化症；对人体的研究发现，ADIPOQ水平能预示Ⅱ型糖尿病和冠心病的发展，并在临床试验表现出抗糖尿病、抗动脉粥样和炎症的潜力。ADIPOQ可作用于骨骼肌增加脂肪酸氧化作用，同时还能作用于肝脏增加胰岛素拮抗糖异生作用，当脂肪过度沉积时，ADIPOQ基因在脂肪组织中的表达量及血液ADIPOQ水平均降低；而体重下降时，ADIPOQ的表达量和血液ADIPOQ水平均升高，ADIPOQ通过蛋白激酶促进骨骼肌脂肪酸的氧化，降低脂质在骨骼肌的堆积，减少游离脂肪酸进入肝脏，改善肝脏胰岛素抵抗，降低肝糖的生成和极低密度脂蛋白的合成。在动物生产中，动物体内脂肪沉积及脂肪含量是影响肉品质的重要因素，动物产品脂肪含量过高不仅影响消费者的健康，而且降低饲料利用率。ADIPOQ的研究，为改善动物胴体品质、生长性能和脂肪沉积的分子育种研究提供理论依据。

发明内容

本发明提供了检测脂联素（Adiponectin，ADIPOQ）基因mRNA表达水平的特异性引物和荧光定量PCR检测试剂盒。通过大量的实验研究，我们优化出了一套能够有效检测不同牛种（包括奶牛、黄牛和牦牛）ADIPOQ基因mRNA表达量的引物和PCR反应的条件，并组装成ADIPOQ基因mRNA表达检测荧光定量聚合酶链式反应试剂盒，以满足生命科学、动物医学和动物科学研究者的检测需要。