[发明专利]鉴定节瓜枯萎病的方法及引物对的应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学DNA标记检测技术领域，尤其是用于节瓜枯萎病鉴定的SRAP分子标记引物及其方法和应用。

背景技术

节瓜又名毛瓜，属葫芦科一年生攀援草本植物，是冬瓜的一个变种，是华南地区重要蔬菜作物之一。

枯萎病由真菌或细菌引致的植物病害，发病突然，症状包括严重的点斑、凋萎或叶、花、果、茎或整株植物的死亡。生长迅速的幼嫩组织常被侵袭。

瓜类枯萎病又称萎蔫病，由半知菌亚门尖镰孢属尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)引起，它以产生的絮状菌丝侵入植物体，成熟后产生大量镰刀状分生孢子和蝗卵状分生孢子进行传播侵染(安重莹等，2009)，传播速度之快、传播范围之广，毁灭性之大，损失之大，危害难以控制；并且根据文献报道(佘小漫等，2011)，瓜类枯萎病菌至少存在8个专化型，即尖孢镰刀菌西瓜专化型〔F.oxyspoorum Schl.f.sp.niveum(E.F.Smith)Snyder&Hansen〕、尖孢镰刀菌黄瓜专化型(F.oxyspoorum Schl.f.sp.cucumerinum Owen)、尖孢镰刀菌甜瓜专化型(F.oxyspoorum Schl.f.sp.melonis Snyder&Hansen)、尖孢镰刀菌葫芦专化型(F.oxyspoorum Schl.f.sp.lagenariae Matuo&Yamamoto)、尖孢镰刀菌冬瓜专化型(F.oxyspoorum Schl.f.sp.benincasae Sun S.K.&Huang J.W.)、尖孢镰刀菌苦瓜专化型(F.oxyspoorum Schl.f.sp.momodicase Sun&Huang)、尖孢镰刀菌丝瓜专化型(F.oxyspoorum Schl.f.sp.luffae Kwai Suzuki&Kawai)和尖孢镰刀菌瓜类专化型(F.oxyspoorum Schl.f.sp.cucurbitacearum Gerlagh M.&Block W.J.)，而各专化型对瓜类作物的致病性存在明显差异，只要了解了瓜类作物属于哪一种专化型，就有对应的防御和治疗措施，但这8个专化型中并没有尖孢镰刀菌节瓜专化型，所以对节瓜开展抗枯萎病分子标记研究，对于疫情的发生进行提前预测，显得尤为重要。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

针对目前生产上利用生物防治和化学防治并不能从根本上了解发病原因，从根本上了解致病特性，本发明提供一种可以对节瓜枯萎病进行早期诊断，及时、快速、准确预警节瓜枯萎病发生的鉴定方法。

本发明首先提供一种SRAP分子标记，所述的分子标记是用于鉴定节瓜枯萎病。

进一步的，所述的分子标记为引物对。

本发明另外一个目的是提供一种引物对，所述的引物对是从所述的SRAP分子标记上筛选的，用于鉴定节瓜枯萎病。

本发明的第三个目的是提供一种用于鉴定节瓜枯萎病的SRAP分子标记的特异性扩增引物对，所述反向引物的核苷酸序列数量为11对大于正向引物的核苷酸序列数量9对。

进一步的，所述正向引物和反向引物的核苷酸序列选自下述组合之一：em9me8，em7me6，em2me5，em10me5，em5me1，em1me5，具体的引物序列表如表1所示；

进一步的，所述正向引物和反向引物的核苷酸序列为em5me1的组合，分别如SEQ ID No.1和No.14所示。

以上所述的特异性扩增引物对在鉴定节瓜枯萎病方面的应用。

本发明的第四个目的在于提供采用SRAP分子标记技术鉴定节瓜枯萎病的方法，采用前面所述em5me1引物对，用PCR扩增体系扩增节瓜枯萎病的基因组DNA，将所得PCR产物进行电泳检测，若PCR扩增产物中出现309bp的特征带，则所鉴定的节瓜感染有枯萎病。

其中，优选的，所述PCR扩增体系为25ul，PCR-buffer是2.5ul，Mg²⁺是2.0ul，dNTPs是0.5ul，tTaq DNA聚合酶是0.3ul，DNA是4ul，引物对是2ul，H₂O是13.7ul；