[发明专利]一种鸡MDA5基因启动子及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种鸡天然免疫相关基因MDA5启动子区域的分离鉴定及其应用。

背景技术

天然免疫又称非特异性免疫或者固有免疫，主要通过天然免疫分子和细胞来具体实现对病原体的清除和杀灭。宿主细胞通过对病原体的识别，激活一系列的下游级联反应，最终导致I型干扰素、促炎症细胞因子、趋化因子等的产生从而抑制病原体的复制、抵抗感染并清除病原体。天然免疫对于病原的识别依赖的是病原分子模式识别受体（PRR）。

黑素瘤差异化相关基因5（Melanoma Differentiation-Associated protein 5，MDA5，又称Helicard、IFIH1） 是胞质内病原分子模式识别受体，维甲酸诱导基因I样受体家族（RLRs），包括维甲酸诱导基因蛋白I （retinoic acid-inducible gene I，RIG-I）；遗传学和生理学实验室蛋白2（laboratory of genetics and physiology 2，LGP2） 的重要成员之一，其激活的信号转导途径对机体启动抗病毒天然免疫发挥着重作用。MDA5是DexD/H RNA解旋酶。N 端包括2 个串联重复的半胱天冬酶募集结构域即CARD（Caspase activation and recruitment domain） 域，中间为DExD/H 解旋酶区（ DExD/H helicases），C端是无活性的抑制域（ repressor domain，RD）。其解旋酶结构域介导双链RNA的识别，而CARD结构域能够招募下游信号分子从而活化干扰素调节因子3(Interferon regulatory Factor 3，IRF3)和核转录因子NF-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB，NF-kB）。

在哺乳动物中，MDA5和RIG-I是RIG-I样解旋酶家族中进化保守的成员，在机体对抗外源RNA病毒感染的过程中起重要的作用。然而，鸡中缺少RIG-I， 因此关于MDA5对病毒的识别，自身的激活以及受到的调控的研究就显得尤为重要，例如解释为何鸡对某些特定的流感病毒有抵抗力，却对另一些毒株具有高易感性，进而找到增强鸡抗病毒能力的方法。

启动子是目的基因的开关，控制基因的表达，因此研究一个基因启动子的影响和调控因素，是明白这个基因作用机制及调节因素的一个重要环节，因此对于一个基因研究其启动子的区间及特性就显得尤为重要。

研究显示，在正常情况下，机体MDA5只有基础水平少量表达，当病毒入侵后，MDA5的表达会大量上调。目前对RIG-I的调控机制研究较多，对MDA5的调控机制尚不清楚，对鸡MDA5基因的启动子的研究未见报道。

发明内容

本发明的目的是研究鸡抗病毒能力，增强鸡的免疫力。提供一种鸡MDA5基因启动子，所述的MDA5基因启动子序列如序列表SEQ ID NO：3所示。利用NCBI数据库查找鸡黑色素瘤差异化相关基因MDA5的上游调控序列，预测MDA5启动子的大概区域。设计如序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物片段，以白羽鸡基因组DNA为模板，PCR扩增其天然免疫的启动子区域，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并用天根回收试剂盒纯化回收，将片段连接在pMD19-T载体上并将扩增到的启动子序列SEQ ID NO：3片段命名为MDA5-pro，其片段长度为2487b。

将连接在pMD19-T载体上的MDA5启动子作为模板，设计引物进行PCR扩增，引进PciⅠ和BamHⅠ两个切酶位点，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并用天根回收试剂盒纯化回收后，用全式金的pEASY-T1 Cloning Kit试剂盒，将其连接在pEASY-T1载体上，获得MDA5基因启动子转染载体。PciⅠ和BamHⅠ两个切酶位点的酶切体系是：

试剂 体积（(Volume/μl)）

Buffer 5

目的片段DNA/载体DNA12/4

PciⅠ 1

BamHⅠ1

ddH₂O31/39

总量 50；

所述的酶切条件是37℃，时间为5-6小时。

一种鸡MDA5基因启动子的应用，所述的MDA5基因启动子用于启动鸡表达目的基因。

以上所述的MDA5基因启动子还可应用于在受到病毒、干扰素、Poly I:C和IBDV刺激后能驱动目的基因表达。