[发明专利]一种基于FRET探针熔解曲线法检测ALDH2基因多态性的试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于体外核酸检测领域，特别涉及一种基于FRET探针熔解曲线法检测ALDH2基因多态性的试剂盒及方法。

背景技术

人乙醛脱氢酶2(ALDH2)是乙醇代谢途径中最重要的酶之一，其编码基因ALDH2具有高度的多态性。在亚洲的黄种人群中，ALDH2是频率最高且最重要的突变型。最近的研究显示，ALDH2能在一定程度上抑制其携带者对酒精的依赖，并与酗酒导致的酒精性中毒、酒精性肝病、上消化道癌及胃癌等疾病之间存在深刻的联系。

ALDH2基因突变使乙醛脱氢酶活性也降低10倍以上，使酒精在体内从乙醇→乙醛→乙酸→水、二氧化碳的代谢过程受阻，大量乙醛滞留在体内，给身体造成伤害。ALDH2基因正常的人，能及时将酒精完全分解为水和二氧化碳；对于这些人，适度饮酒有利于健康。ALDH2基因突变的人，不能快速的完成酒精代谢过程，导致乙醛在体内堆积，对人的肝、肾、心、脑造成严重伤害。这些人如果饮酒不当，将会对身体造成严重损害。在中国人中，约30％-50％的人为ALDH2基因异常人群。

ALDH2基因多态性不仅与酒精在人体内的分解代谢有关，还参与硝酸甘油的代谢。舌下含服硝酸甘油片是抗冠心病心绞痛急性发作的常规首选方法，但该药的临床有效性常因人而异，有些患者服用之后并无疗效。研究发现，人体内的ALDH2具有硝酸酯酶活性，是硝酸甘油的有效代谢物一氧化氮形成的关键，如果病人基因中携带有ALDH2突变，乙醛脱氢酶2的硝酸酯酶活性会降低10倍以上，使硝酸甘油无法产生一氧化氮，难以发挥药效。因此，检测ALDH2基因型为医生合理使用硝酸甘油提供有力参考，减少用药无效导致的意外死亡。

检测ALDH2基因多态性，不仅能够指导人们根据自己的基因型正确饮酒，从而减少酒精引起的身体伤害，真正做到健康饮酒；还可以帮助医生筛查患者是否适合服用硝酸甘油。在临床上具有重要的检测意义。

基因多态性检测方法已经日趋成熟，目前应用比较广泛的技术平台有以下几种：首先是传统的RFLP(限制性片段长度多态性)法，通过特定限制性内切酶识别特异的序列，通过琼脂糖凝胶电泳结果即可分析基因多态性，此方法成本较低，使用普通的仪器即可完成实验，但是操作繁琐，开盖操作较容易造成气溶胶污染，并且酶切不完全往往被误判为杂合子，特异性较差。第二种方法是作为“金标准”的基因测序，测序结果直观明了，并且具有较高的特异性，但是因为测序仪器较昂贵，无法普及。基于Taqman探针扩增曲线法，能够有效避免开盖污染的问题，同时检测仪器在众多高校、医院等科研医疗单位均已普及，不过特异性不够理想，很容易产生非特异信号，优化难度较高，检测结果受样本质量影响较大。使用MGB修饰的探针，能够解决特异性的问题，但是合成成本较高，并且合成途径受到限制。

故现有技术有待改进和发展。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种特异性好，灵敏度高，通过仪器读取的TM值即可直观明了地判读结果的基于FRET探针熔解曲线法检测ALDH2基因多态性的试剂盒及方法。

本发明的技术解决方案是：一种基于FRET探针熔解曲线法检测ALDH2基因多态性的试剂盒，包括特异扩增基因ALDH2(rs671)位点的正向引物和反向引物，以及一对特异区分基因ALDH2(rs671)位点多态性的荧光标记探针；

引物、探针具体序列信息如下：

F：5’-AGCAGACCCTAAATCCCTGG-3’；

R：5’-CACCAGCAGACCCTCAAG-3’；

sensorprobe：5’-TGCAGGCATACACTGAAGTGAAAACTGT-FAM-3’；

anchorprobe：5’-ROX-AGTGTGGGACCTGCTGGGGGCT-P-3’。

该试剂盒还包括扩增反应试剂PCRMix，其成分包含为：1×PCRBuffer，3mMMgCl2溶液，2.5mMdNTP溶液，1μΜF，1μMR，0.25μMsensorprobe，0.3μManchorprobe。

一种基于FRET探针熔解曲线法检测ALDH2基因多态性的试剂盒的方法，包括如下步骤：

S1：DNA提取；

S2：配置PCR反应液，包含n×19.6μLPCRMix和n×0.4μL酶液，其中酶液包含：5U/μlTaqHS；依次在95℃预变性10min；95℃变性10s，60℃退火60s，45个循环；得到扩增产物；

S3：在45℃～80℃，0.2℃采集一次荧光做熔解曲线分析；