[发明专利]使用重组酵母全细胞的猪圆环病毒(PCV2)亚单位疫苗及其制造方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于为母猪和猪崽接种疫苗的重组的猪圆环病毒(PCV2)亚单位疫苗及其生产方法，该重组的猪圆环病毒(PCV2)亚单位疫苗包括重组的酵母全细胞并且可预防猪圆环病毒(PCV)相关的疾病。

背景技术

猪圆环病毒2(PCV-2)已知是断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)的主要致病源的病毒。难以开发能够预防猪圆环病毒造成伤害的疫苗的原因是，使用动物细胞生产疫苗需要相对昂贵的培养基和动物细胞培养系统，以及在血清培养基中所含的各种异源蛋白有可能在接种期间产生副作用。

四种基于来自PCV2a病毒的ORF2抗原的PCV2疫苗正在全球市场上出售。在外国，在技术上处于最高水平的公司是梅里亚(Merial，法国)，该公司有很多与PCV相关的专利，并且使用经灭活的PCV2全病毒(Circovac)。勃林格殷格翰(BoehringerIngelheim)开发了一种通过在杆状病毒中表达ORF2所获得的基于重组蛋白的疫苗(避开了PCV和Ciroflex)，其中该疫苗的优点在于纯化之后每次以1ml的量进行注射。英特威(Intervet)有限公司通过在杆状病毒中表达ORF2并且纯化表达产物也开发了一种基于重组蛋白的疫苗，其中该疫苗被设计为以3周的间隔，以2ml的量注射到猪崽体内两次。FortDodge有限公司通过在PCV-1病毒中表达PCV2的ORF2开发了一种嵌合体疫苗，其中该嵌合体疫苗以2ml的量一次注射到猪崽体内。

在重组病毒的亚单位疫苗的情况中，形成病毒样颗粒(VLP)能增加疫苗的抗原性是已知的。在酵母的情况中，已经开发了利用酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株中的Ty1(一种很久之前就已知的逆转录转座子元件)的技术。Ty1在基因、结构和功能上与逆转录病毒的核苷/核相似。在1987年报道了使用Ty1获得的疫苗，并且当疫苗候选基因与Ty1基因的3’区域融合并且进行表达时，有如下优点：不阻碍病毒样颗粒的形成并且可在细胞中形成病毒样颗粒，而不需要其它分离的因子。有几篇报道指出：当在酵母中生产疫苗时，酵母细胞壁组分还可用作佐剂(ChanGC,ChanWK,SzeDM.2009,Theeffectsofbeta-glucanonhumanimmuneandcancercells.JHematolOncol2:25)。

已知的是，如果裂解酵母细胞以提取在细胞中表达的抗原，则在制备细胞裂解液之后，诸如病毒样颗粒的抗原难以稳定地保持在溶液中。此外，还可能需要各种添加剂(例如，诸如聚山梨醇酯20的表面活性剂，诸如蔗糖、海藻糖或山梨糖醇的糖，等等)，来防止病毒样颗粒发生聚集和沉淀(LangR,WinterG,VogtL,ZuercherA,DorigoB,SchimmeleB(2009))。被开发用来克服上述缺点的使用酵母全细胞的重组疫苗可享有酵母能表达一种或多种抗原、具有高稳定性并且还易于进行大量生产的优点。

本发明人已经发现，表达猪圆环病毒抗原ORF2的酵母全细胞疫苗具有非常高的免疫原性，从而完成了本发明。

发明内容

技术问题

本发明的目标是提供一种表达重组载体的酵母全细胞，或该细胞的裂解液，包括细胞或其裂解液的猪圆环病毒疫苗组合物，以及它们的生产方法，其中重组载体包括编码猪圆环病毒的II型衣壳蛋白的基因ORF2。

技术方案

在本发明的一个实施方式中，提供了一种用于猪圆环病毒疫苗的酵母全细胞，所述酵母全细胞包括猪圆环病毒的II型衣壳蛋白ORF2。在该实施方式中，基因ORF2可以是由SEQIDNO:1表示的基因。酵母用作宿主细胞，并且可以是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的菌株。具体地，所述酵母可以是Y2805菌株。此外，所述酵母全细胞可经热灭活或者经福尔马林灭活。

在本发明的另一实施方式中，提供了一种用于猪圆环病毒疫苗的酵母全细胞的裂解液，所述酵母全细胞的裂解液包括猪圆环病毒的II型衣壳蛋白ORF2。基因ORF2可以是由SEQIDNO:1表示的基因。酵母用作宿主细胞，并且可以是酿酒酵母Saccharomycescerevisiae的菌株。具体地，所述酵母可以是Y2805菌株。此外，所述酵母全细胞可经热灭活或者经福尔马林灭活，并且所述酵母全细胞的裂解液可来源于经热灭活或经福尔马林灭活的酵母全细胞。