[发明专利]一种S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶的活性检测方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(S-adenosylmethionine decarboxylase；AdoMetDC)，具体涉及人源S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶活性检测方法和及在药物筛选上的应用。

背景技术

蛋白质是生物体的主要组成成分之一，是完成各种生命活动的主要物质。在各种蛋白质中，蛋白酶对生命活动至关重要，几乎所有生物体内的生化反应过程都由蛋白酶进行催化。生物体内各种蛋白酶的活性具有严格的调控机制，一旦其调控机制出现问题，造成蛋白酶的活性过高、过低或者是完全失活，都会造成相应的各类疾病。因此，通过药物来调控蛋白酶的活性，使其恢复和保持在正常水平，具有非常重要的理论意义和现实意义。以结构为基础的药物设计，是设计以蛋白质为靶标的药物的一个非常重要的手段。

多胺(polyamines)是一类从氨基酸代谢产生的带正电的阳离子小分子，在所有生物体中都存在，对细胞生长、分化、存活及正常生物学功能等都不可缺少。多胺带多正电荷的特性，使它们能通过与带负电荷的生物大分子(DNA、RNA、蛋白质、细胞膜等)形成静电作用，从而调控非常广泛的生物学过程，包括染色体结构形成、DNA合成与稳定、DNA复制、转录和翻译、蛋白质磷酸化、核糖体生成、离子通道和膜表面受体的调控、自由基清除等。天然的多胺有很多种。在哺乳动物中，天然存在的有三种，即putrescine(腐胺),spermidine(精脒),spermine.(精胺)，它们对哺乳动物正常生长和发育必不可少。由于多胺具有重要的生物学功能，其细胞内水平受到严格的调控。在快速繁殖的细胞(如肿瘤细胞)中，多胺水平也会上升和失调。多胺水平升高，伴随着细胞增殖加快、凋亡减少、以及肿瘤浸润和转移相关基因的表达水平升高等。因此，多胺的调控，成为肿瘤治疗和药物研发中的一个重要手段。

AdoMetDC是多胺体内合成的一个关键酶，对于精胺和精脒的合成至关重要，因为精胺和精脒的氨丙基来源于AdoMetDC的脱羧反应。因此，合成AdoMetDC抑制剂，抑制精胺和精脒的生成，是目前很受关注的一个肿瘤治疗途径。同时，由于病原微生物也需要维持正常的多胺水平，因此AdoMetDC抑制剂也成为针对病原微生物的一个重要药物靶标。

当前，AdoMetDC的抑制剂MGBG(米托胍腙)已经被用于临床中的抗白血病治疗和癌症的化疗辅助药物。但MGBG会导致严重的线粒体损伤，因此毒副作用非常大。AdoMetDC的抑制剂CGP 48664(SAM486A)已经进入I期和II期临床评估。因此，筛选和设计新的AdoMetDC抑制剂具有重要意义和价值。

在筛选和设计AdoMetDC抑制剂的过程中，一个很重要的评价指标是检测药物对AdoMetDC的酶活性抑制能力。目前，检测AdoMetDC的活性和抑制剂效果，比较有效的是采用C14同位素标记的腺苷甲硫氨酸([¹⁴COOH]AdoMet)进行实验，通过检测¹⁴CO₂的产生进行评价。该方法虽然很灵敏和准确，但是由于涉及到同位素操作，需要特殊的设备和操作，药品价格也比较昂贵，因此普通实验室难以使用，且无法用于高通量的AdoMetDC药物筛选。因此，开发出价格低廉、操作简便、普适度高的AdoMetDC活性检测体系，具有重要价值。

发明内容

本发明的目的是确定建立一个简便的、非放射性同位素标记的AdoMetDC活性检测的方法，用于AdoMetDC的活性检测和抑制剂评价、筛选和设计。

本发明的技术方案是，基于脱羧酶产生CO₂的原理，利用二氧化碳测定的PEPC酶法，通过调节有关组成成分，确定了一个能够进行AdoMetDC活性检测和抑制剂效果评价的测活方法。该方法的R1和R2试剂的主要组成如下：

所述的腺苷甲硫氨酸的浓度为0.01-500mM，S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(AdoMetDC)的浓度为0.1-100uM。

进一步优选为：

所述的R1的混合试剂为7.0mmol/L的磷酸烯醇式丙酮酸及8.0mmol/L的氯化镁的混合溶液；R2的混合试剂为400U/L的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，600U/L的苹果酸脱氢酶，0.45mmol/L的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的混合溶液；腺苷甲硫氨酸的浓度为1mM；S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(AdoMetDC)的浓度为1uM。