[发明专利]联用三种单克隆抗体偶联免疫磁珠在肿瘤细胞分选中应用

说明书

本发明公开了一种联用三种抗HLA‑G、EpCAM和CK8/18的单克隆抗体偶联免疫磁珠在肿瘤细胞分选中的应用。本发明还提供一种乳腺癌肿瘤细胞的分选方法，其制备三种偶联抗体的免疫磁珠联合应用对乳腺癌肿瘤细胞富集率较高，敏感性及可重复性均较好，均可以检出相关的肿瘤细胞。本发明联用三种免疫磁珠(EpCAM，HLA‑G，CK8/18)进行肿瘤细胞富集，最大程度上扩大了循环肿瘤细胞的覆盖率，富集率达到80%，此技术是国际首创。特别是抗HLA‑G的单克隆抗体磁珠的使用，保证了肿瘤细胞富集的特异性和敏感性。

技术领域

本发明涉及一种分选肿瘤细胞的方法，特别是涉及一种以应用抗HLA-G抗体为核心的, 三种抗HLA-G、EpCAM、CK8/18抗体偶联磁珠,联用三种偶联抗体的免疫磁珠分选乳肿瘤细胞的方法。

背景技术

循环肿瘤细胞在外周血中的数量极少,通常在约1亿个白细胞和500亿个红细胞中仅有数个肿瘤细胞，大约每10⁵～10⁷个单核细胞中才有一个循环肿瘤细胞。因此，为了提高循环肿瘤细胞的检出率,通常需在检测前进行循环肿瘤细胞的富集。细胞富集可通过肿瘤细胞的特异性标志物(免疫分离)或细胞形态特征如细胞体积和密度等来实现。

常用的细胞富集技术主要有免疫磁分选、密度梯度离心和细胞过滤等。

1.1密度梯度离心法：是一种基于物理学特性、利用在一定离心力下细胞之间沉降率不同分离细胞的技术。这是实验室一项常用的技术，用于分离单核细胞等。利用这项技术建立的 Onclquick(Greiner Bio-One,Frickenhausen，Germany)和Ficoll-Hypaque分离法，利用专用的多孔屏障和密度梯度分离液，在一定离心力下分离出肿瘤细胞。这项技术设备简单操作简便，能得到细胞的完整形态，便于进一步鉴别，在部分临床研究中显示出一定的临床意义，但是敏感性和特异性均不高，肿瘤细胞回收率低，限制了其临床应用。

1.2膜过滤法：是利用肿瘤细胞直径与血液细胞的区别，通过一定孔径的膜来过滤细胞而达到分离细胞的目的。同密度梯度离心法不一样，这项技术是利用细胞的形态学特点来富集肿瘤细胞的技术。一般血细胞直径在8-11μm之间，而肿瘤细胞相对直径较大(例如乳腺癌细胞直径约30μm)，借此区别以分离肿瘤细胞和正常血液细胞。肿瘤细胞与部分血液细胞的差别并没有那么明显，是该技术被人话病的方面，但是它的优势同样明显：更多类型的肿瘤都适合利用大小来区分正常血液细胞而不因表面标志缺失或者肿瘤异质性导致的漏检。第一个采用此法的是ISET(Isolation by Size of Epithilial Tumor cells),该方法设备简单，操作方便，而且细胞表面标记能完整保留；聚集的在一起的肿瘤细胞更容易分离，利于后续的进一步检测。但是，循环中的肿瘤细胞孔径不是均一的，在免疫系统攻击及血液剪切力的作用下往往发生变形，因此膜孔径的大小设定是个难题。有研究认为5μm的孔径分离效果好，但是敏感性受到质疑。在此基础上新发展的ScreenCell分离法，得到的肿瘤细胞除可常规检测外还可用于细胞培养，且有较好的敏感性。

鉴于依照肿瘤细胞大小的分离方法的优势，目前依据细胞大小分离肿瘤细胞的微过滤技术研发成功，初期的实验结果显示其比抗原抗体结合分离法有更高的灵敏性，更方便进行分子检测，下面为相关的专门描述。