[发明专利]检测肿瘤标志物电致化学发光免疫传感器的制备及应用

说明书

技术领域

本发明涉及免疫标记物检测技术领域，更具体的说是一种电致化学发光免疫传感器的制备，本发明还涉及采用所述的电致化学发光传感器检测肿瘤标志物的方法。

背景技术

一直以来，恶性肿瘤也就是癌症，是人类健康和生命安全的一个严重威胁。癌症细胞，是指一些拥有分裂潜能的细胞在致癌因素的作用下发生了恶性转化和克隆性增生而产生的一种新生物。并且癌细胞除了自身的生长失控外，还会侵入周围正常组织甚至可以经由体内的循环系统或者淋巴系统转移到身体的其他部分，从而引起身体病变甚至死亡。所以，癌症早期的诊断和及早的治疗具有重要的意义。但是癌症早期的抗原含量较低很难被发现，低含量的抗原的测定成为了分析人员的重要追求。

近年来，免疫分析是临床检验中一项重要的肿瘤疾病的诊治手段。免疫分析法是利用抗体与抗原特异性结合反应检测各种物质，如药物、激素、蛋白质、微生物等的高选择性生物化学方法。生物免疫分析技术具有灵敏性高、操作简单、成本低、特异性高、干扰小、安全无毒和重现性好等特点。并可对大量样品进行常规分析，用于样品的定性筛选、定量测定、确定样品中待测组分的含量。当前免疫分析检测方法几乎用在了所有的常用药品上，大部分运用于药品残留的检测，随着分析技术的日趋完善，单克隆抗体、重组单链抗体，以及免疫传感器和芯片技术的不断发展，该技术在食品安全、快速分析检测领域将发挥越来越重要的作用。

免疫分析包括非标记性免疫分析和标记性免疫分析。非标记免疫包括免疫扩散和免疫电泳，是可溶性的抗原和相对应的抗体在溶液或凝胶中进行接触，从而形成一种不溶性抗原-抗体复合物进行分离的技术。标记性免疫分析技术是采用光电物质、同位素或酶等示踪物质来标记抗体或抗原进行抗原-抗体反应，通过对免疫复合物中的标记物信号的测定，从而达到对免疫反应进行监测的目的。标记性免疫分析技术包括放射免疫分析、酶联免疫吸收分析、毛细管电泳化学发光免疫分析、高效液相色谱化学发光免疫分析、微流控芯片化学发光免疫分析、电化学免疫分析、电致发光免疫分析、荧光免疫技术、胶体金免疫技术和铁蛋白免疫技术等。但是这些免疫分析方法一般耗时较长并且拥有繁琐的加样、温育、洗涤等操作过程，而且操作人员和免疫物质的接触较多，可能对操作的人员的身体健康造成危害。而且有些测定速度快、灵敏度高、检测限低的检测手段需要仪器昂贵，不能在发展中国家普及。

基于以上技术，我们需要找一种廉价简单的操作方法，实现高灵敏度检测。导电玻璃是一种相对较廉价的材料，我们将传感器建立在导电玻璃上，可以成为一种便携式的免疫分析玻璃芯片，然后结合复合纳米材料的优点，可以实现对肿瘤标志物的高灵敏度低含量检测。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供了一种灵敏度高、检测速度快、试剂用量少，检测肿瘤标志物的电致化学发光传感器。

为了解决上述技术问题，本发明是通过以下措施来实现的：一种检测肿瘤标志物的电致化学发光传感器的制备方法，其包括以下步骤：

（1）将导电玻璃切割成所需要的大小，并进行预处理；

（2）利用已有方法在ITO导电玻璃方形区域内聚合上聚苯胺，并合成g-C₃N₄、银金核壳纳米球及金属氧化物，氧化物包括氧化锌、氧化铜、二氧化锰；

（3）羧基化g-C₃N₄，用连接剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺混合液将其固定在聚苯胺上，用于固定一抗；

（4）将银金核壳纳米球修饰在金属氧化物上，然后将二抗修饰在银金核壳纳米球上；

（5）将制作好的电致化学发光传感器结合电致化学发光仪对肿瘤标志物进行检测。

本发明所述聚苯胺/ g-C₃N₄及金属氧化物/银金合金的制备包括以下步骤：

（1）将导电玻璃先被切成4 cm×1 cm的长条，用乙醇、丙酮和二次水依次进行15 min超声波洗涤，通过Adobe Illustrator制作用于凡士林印刷模板的模具，将凡士林涂在ITO导电玻璃上的特定区域；

（2）聚苯胺的制备：聚苯胺的制备是通过电聚合制备的，由导电玻璃作工作电极、铂电极作对电极，Ag/AgCl电极作参比电极组成的三电极体系中进行的，电解液由4.00 mL 3 M的硝酸和0.40 mL苯胺组成，在工作电极上所施加的电压以0.1 V·s^-1的扫描速度在-0.2-1.2 V之间循环，由此制得聚苯胺；