[发明专利]一种酶法生产α-酮戊二酸的方法

权利要求书

1.一种酶法生产α-酮戊二酸的方法，其特征在于：其生产方法包括以下步骤：

步骤一、同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌的构建

 (1)、表达载体pET24a-glr的构建

a、根据全球公共数据库GenBank，登录号AB003685.1所述记载来自于枯草芽孢杆菌IFO 3336编码谷氨酸消旋酶的glr基因序列，两端分别加上酶切位点NdeI和BamHI，起始密码子由TTG改为ATG后，进行全基因合成，合成的glr基因具体序列如SEQ ID NO：1；

b、将合成的glr基因用NdeI和BamHI双酶切，纯化备用；

c、抽提大肠杆菌表达载体pET24a，用NdeI和BamHI双酶切，与上步纯化的glr基因片段连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；

d、挑取阳性转化子并测序鉴定后，抽提质粒获得glr表达载体pET24a-glr；

(2)、表达载体pET24a-daao的构建

a、根据全球公共数据库GenBank，登录号AB003685.1所述记载来自于变异三角酵母CBS4095菌株中编码D-氨基酸氧化酶的基因daao序列，两端分别加上酶切位点NdeI和BamHI后，进行全基因合成，合成的daao基因具体序列如SEQ ID NO：2；

b、将合成的daao基因用NdeI和BamHI双酶切，纯化备用；

c、抽提大肠杆菌表达载体pET24a，用NdeI和BamHI双酶切，与上步纯化的daao片段连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；

d、挑取阳性转化子并测序鉴定后，抽提质粒获得daao表达载体pET24a-daao；

 (3)、同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌的构建

a、将构建好的表达载体pET24a- daao，用BglII和HindIII双酶切，回收包含了T7启动子、核糖体结合位点和daao基因编码序列的片段，纯化备用；

b、构建好的表达载体pET24a-glr，用BamHI和HindIII双酶切，纯化，利用BglII和BamHI同尾酶的特性与上述a中所准备好的基因片段连接，得到连接后基因片段，备用；

c、将上述连接后基因片段转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性转化子并测序鉴定；抽提质粒获得glr和daao双表达载体pET24a-glr-daao；

d、将双表达载体pET24a-glr-daao转入大肠杆菌BL21（DE3）菌株中，获得可以诱导同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌；

步骤二、基因工程菌的培养

将上述步骤一所制备的同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌进行培养，培养的过程中加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，最后收集菌体，得到同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌，备用；

步骤三、以L-谷氨酸为原料，转化生产α-酮戊二酸

在发酵罐中加入同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌湿菌体至水中，湿菌体的质量为水质量的3-5%，然后加入L-谷氨酸至终浓度90-100g/L，再加入过氧化氢酶至浓度为100万-400万单位/升，最后用氢氧化钠调pH至7.5-8.2，即制备出反应体系；水浴保持反应体系在30-40℃，通气搅拌反应，即将反应体系中的L-谷氨酸转化为α-酮戊二酸；检测反应体系中α-酮戊二酸的含量；

步骤四、α-酮戊二酸的分离纯化

将反应体系中转化出的α-酮戊二酸进行分离纯化即生产出α-酮戊二酸。