[发明专利]一种兽用卵泡刺激素类似物的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种兽用卵泡刺激素类似物的制备方法。

背景技术

卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone，FSH)是由动物脑垂体前叶嗜碱性细胞合成和分泌的一种糖蛋白激素，由α和β两条多肽链(或称亚基)以非共价键联结而成。可以促进雌激素的分泌、诱导动物发情、促进卵泡卵子成熟、超数排卵和刺激精子生成。

目前兽用FSH均为动物脑组织提取物，不但参杂不同含量的促黄体素致使超排效果不稳定，还有携带生物源性传染物的潜在危险。通过基因工程研发兽用FSH，是当前的研究热点。迄今已见诸于报道的有关基因重组FSH的基因工程策略主要有两种。一种是α和β两条多肽链分别表达后，再通过非共价键联结形成异源二聚体。这种方法受该两条多肽链彼此联结的效率所限，因而许多研究者转而研究如何把α和β两条多肽链在基因水平连接在一起，从而编码为单一肽链的融合蛋白。其中在α和β两条多肽链之间起连接作用的氨基酸序列称为连接序列(Linker)。Weenen等(J Clin Endocrinol Metab，2004，89：5204-5212.)以及美国专利申请公告US 2008/0234186 A1通过人FSH的α和β两条多肽链与不同的连接序列重组，比较所形成的融合蛋白的活性。在连接序列内分别引进含1、2和4个N-连接糖基化位点序列，或采用人绒毛膜促性腺激素β亚基的羧端肽(CTP)作为连接序列。所得到的融合蛋白FSH-N1、FSH-N2和FSH-N4、和FSH-CTP的糖基化程度和体内半衰期均较野生型FSH明显增加，但体内半衰期与糖基化程度的增加并不呈简单的线性关系。该发明强调了糖基化对长效的作用，但未充分考虑到连接序列本身对于融合蛋白表达的影响。结果表明其表达量都仅在1.3-14pmol/ml的范围之内(J Clin Endocrinol Metab，2004，89：5204-5212和美国专利申请公告US2008/0234186 A1)。

连接序列的长度、可折叠性、疏水性、电荷效应等特性与融合蛋白中的α和β肽链在彼此联结之前能否各自折叠成为正确的空间结构密切相关。两条肽链以及其间的连接序列，这三者空间三维结构的相互关系直接影响融合蛋白的生物活性，也影响融合蛋白的产量。所以适应于α和β肽链的连接序列碱基的选择及其排列顺序至关重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种兽用卵泡刺激素类似物及其制备方法。针对上述现有技术存在的问题，根据α和β肽链间连接序列的长度、可折叠性、疏水性、电荷效应来设计连接序列从而得到不同的兽用卵泡刺激素类似物。对由不同连接序列融合而成的不同的卵泡刺激素类似物的产量和生物活性进行比较与筛选，从中选出高表达量的最佳序列。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：

一种兽用卵泡刺激素类似物，所述兽用卵泡刺激素类似物中，根据α和β肽链间连接序列的长度、可折叠性、疏水性、电荷效应来设计连接序列，其连接序列对应的核苷酸序列为：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20中的任一种。

进一步的，所述连接序列对应的核苷酸序列为：SEQ ID NO13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18中的任一种。

进一步的，所述兽用卵泡刺激素类似物制备方法包括如下步骤：

步骤一、将Genbank上记载的天然羊卵泡刺激素两个亚基β和α基因并在其间插入已知连接序列(两端含酶切点)，进行全序列合成(SEQ ID NO：1)，再用pcDNA3.1(+)质粒进行分子克隆。分别