[发明专利]一种兽用卵泡刺激素类似物的制备方法

权利要求书

1.一种兽用卵泡刺激素类似物，其特征在于，所述兽用卵泡刺激素类似物中，根据α和β肽链间连接序列的长度、可折叠性、疏水性、电荷效应来设计连接序列，其连接序列对应的核苷酸序列为：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20中的任一种。

2.根据权利要求1所述的兽用卵泡刺激素类似物，其特征在于，所述连接序列对应的核苷酸序列为：SEQ ID NO13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18中的任一种。

3.根据权利要求1或2任一权利要求所述的兽用卵泡刺激素类似物，其特征在于，所述兽用卵泡刺激素类似物制备方法包括如下步骤：

步骤一、将Genbank上记载的天然羊卵泡刺激素β和α亚基的基因通过两端分别含BamHI、SpeI酶切点的已知连接序列连接起来，进行全序列合成，其序列为SEQ ID NO：1，两端分别函Nhe I和EcoR I酶切点，再用pcDNA3.1(+)质粒进行分子克隆；经过双酶切，依次用下列19个序列取代上述的已知连接序列，SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20，以制备19种不同的新的表达质粒；将所得表达质粒转染DH5大肠杆菌，经氨苄青霉素抗性筛选，提取单克隆菌落质粒DNA，酶切鉴定后进行测序；

步骤二、重组质粒DNA序列经确认之后，进行单酶切，使之线性化，线性化后转染CHO细胞，经G418抗性筛选，单克隆化，通过western blotting挑选高表达克隆；

步骤三、进行逐级放大传代培养扩增，western blotting检测培养液，证实重组FSH高表达，细胞加防冻剂，分装液态氮冻存；

步骤四、复苏，经含血清培养基培养，无血清培养驯化，逐级放大传代培养扩增，证实重组FSH高表达，作为种子细胞加防冻剂，分装液态氮冻存。

4.根据权利要求3所述兽用卵泡刺激素类似物，其特征在于，所述兽用卵泡刺激素类似物制备方法步骤一中，目的基因全序列插入pcDNA3.1所需的双酶切的内切酶为：限制性内切酶Nhe I和EcoR I；置换连接序列所需的内切酶为：BamHI和SpeI。

5.根据权利要求3所述兽用卵泡刺激素类似物，其特征在于，所述兽用卵泡刺激素类似物制备方法步骤二中，单酶切的限制性内切酶为Psp1406I。

6.根据权利要求3所述兽用卵泡刺激素类似物，其特征在于，所述兽用卵泡刺激素类似物制备方法步骤二中，所述G418抗性筛选的浓度为800μg/ml。

7.根据权利要求3所述兽用卵泡刺激素类似物，其特征在于，所述兽用卵泡刺激素类似物制备方法步骤三中，分别选取25cm²、75cm²、175cm²、225cm²的细胞培养瓶进行逐级放大传代培养扩增。

8.包含权利要求1或2任一连接序列的兽用卵巢刺激素类似物及含有该兽用卵巢刺激素类似物的药物在促进卵泡发育方面的应用。