[发明专利]二化螟羧酸酯酶及其编码基因、制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因生物工程领域，具体涉及一种二化螟羧酸酯酶及其编码基因、制备方法和应用。

背景技术

农药是人类主动大量投放到环境中的一类具有生物毒性的化学物质。目前，我国农药过量使用的问题十分严重，大量施用的农药仅约1％能发挥药效，其余大多残留于土壤、飘浮于大气中或通过径流进入水域，严重危害生态环境和人类食品安全，进而损害人类健康。我国农产品的农药残留污染十分普遍且相当严重，而且我国人群因农药及其残留污染而引起的急慢性中毒现象较为普遍。此外，长期大量使用化学农药还会导致害虫产生抗药性，使得防效降低或丧失。害虫抗药性的产生导致用药量和防治成本增加，并趋向于更高毒性农药使用，进而又加重环境污染，呈现恶性循环。害虫抗药性的形成还使得农药使用期限大为缩减，这对新农药创制提出了更高的要求。尽管因不合理使用农药而引发一系列的生态环境和人类健康等问题，但鉴于有害生物易爆发成灾的特点，化学农药在当前乃至今后的应急防治体系中仍将占据中心地位。所以，加强农药污染监测和控制是全世界各国关注的重点问题。

目前，常用的农药残留检测方法主要有薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法和快速检测法如胆碱酯酶抑制法及其基础上发展形成的酶生物感应器等。薄层色谱准确度不高；气相色谱和液相色谱灵敏度好，准确度高，但需要的仪器设备投入大，操作复杂，检测成本高，也不便于现场检测。以昆虫乙酰胆碱酯酶为基础的快速检测法已应用于农药的残留检测中，昆虫乙酰胆碱酯酶是一种催化乙酰胆碱分解的水解酶，具有能被OPs和CBs类农药强烈抑制的特性。乙酰胆碱酯酶通过与OPs和CBs类农药结合，来检测农药的残留量，但是该类检测手段常会受到乙酰胆碱酯酶种类缺乏、以及灵敏度、选择性和稳定性问题的影响，最终造成商业化应用受到限制。因此，如何能够找到稳定、高质量的酶源解决是上述问题的关键。

发明内容

本发明提供了一种高表达量和高活性的二化螟羧酸酯酶。

一种二化螟羧酸酯酶，具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

本发明还提供了一种编码所述二化螟羧酸酯酶的基因。

优选的，所述的基因的碱基序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了一种包含所述基因的重组载体和转化子。

本发明又提供了一种所述二化螟羧酸酯酶的制备方法，包括：

(1)将二化螟羧酸酯酶基因亚克隆到转移载体的多克隆位点中，获得重组转移载体；

(2)将重组转移载体转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中，筛选阳性克隆，提取重组杆状病毒穿梭载体；

(3)用重组杆状病毒穿梭载体转染宿主细胞，培养宿主细胞，并分离获得重组杆状病毒；

(4)将重组杆状病毒感染昆虫细胞，并培养转染后的昆虫细胞，分离、纯化二化螟羧酸酯酶。

所述转移载体为pFastBac-HTB。该供体质粒含有mini-Tn7转座子可在大肠杆菌DH10Bac中将该质粒中含有二化螟羧酸酯酶基因的表达框移至杆状病毒穿梭载体Bacmid中，实现大肠杆菌内重组病毒的构建。

所述宿主细胞为昆虫Tn细胞、Sf细胞和Bm细胞中的一种。

本发明还提供了所述二化螟羧酸酯酶在农药检测或降解上的应用。

具体的，所述农药为有机磷、氨基甲酸酯或拟除虫菊酯杀虫剂。

具体的，所述农药为氯氰菊酯。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明从二化螟4龄幼虫中克隆到二化螟羧酸酯酶基因，再通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统快速产生重组病毒，并在昆虫细胞中成功获得高表达量和高活性的二化螟羧酸酯酶。

本发明所述二化螟羧酸酯酶不仅可应用于农药的检测，还可应用于农药的降解，解决了目前昆虫乙酰胆碱酯酶种类缺乏的问题，提供了一种新的农药检测途径。

附图说明

图1是重组转移载体PCR鉴定的琼脂糖凝胶电泳图；

图2是纯化后二化螟羧酸酯酶的SDS-PAGE电泳图和Western印迹图。

具体实施方式