[发明专利]一种提高大肠杆菌正丁醇耐受性的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物化工领域，特别涉及一种提高大肠杆菌正丁醇耐受性的方法。

背景技术

大肠杆菌具有生长快、技术操作相对简单、大规模发酵成本低等优点，是目前基因工程中的模式菌株和最为常用的外源蛋白原核表达系统。此系统可作为“细胞工厂”而生产许多人们需要的代谢产物，然而菌体常常需要在一些不利的环境中培养，各种代谢产物的积累，不仅会降低菌体自身RNA、DNA、蛋白和脂类等的合成速度，而且严重抑制重组菌的生长。对菌体进行有效改造，提高大肠杆菌对不利环境条件的忍耐性和适应性已成为微生物技术应用所需解决的一个重要问题。菌体对环境改变所做出的自身调节，或对一些恶劣条件忍耐性和适应性的形成涉及到整个代谢网络的调整，由许多基因共同作用，目前其相关机理仍没有完全明确。

转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，它控制着基因转录的开关、增强或减弱。大多数细胞功能是由一组基因互相作用形成功能模块来共同执行的，当转录因子调控的基因数目很大时，它参与多种细胞功能的可能性也大大增加，这意味着转录因子与被调控基因的功能多元化是相关的。转录因子FNR正是处于基因转录调控网络的最上层，能够直接或间接的调控菌体全基因组的转录水平，可以在FNR和多种细胞功能之间建立起一定的联系。因此，可以通过改变FNR的蛋白结构，影响其所调控各种基因的转录水平，调节整个菌体的代谢网络，进而改进大肠杆菌的菌体性状。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种提高大肠杆菌正丁醇耐受性的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种提高大肠杆菌正丁醇耐受性的方法，包括以下步骤：

（1）将大肠杆菌菌株E. coli DH5α中的野生型fnr基因克隆到pKSC质粒上，得到重组载体pKSC-fnr，野生型fnr基因的序列如SEQ ID NO.1所示，野生型fnr的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，pKSC质粒的序列如SEQ ID NO.3所示，重组载体pKSC-fnr的序列如SEQ ID NO.4所示；

（2）碱基替换：将步骤（1）得到的重组载体pKSC-fnr上的fnr基因进行碱基替换：C512T，得到优化的重组载体pKSC-fnr1；碱基替换：G286T，T428A，得到优化的重组载体pKSC-fnr2；fnr1基因的序列如SEQ ID NO.5所示，fnr1的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，fnr2基因的序列如SEQ ID NO.7所示，fnr2的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，pKSC-fnr1的序列如SEQ ID NO.9所示，pKSC-fnr2的序列如SEQ ID NO.10所示；

（3）分别用pKSC-fnr1和pKSC-fnr2中的fnr1和fnr2基因替换大肠杆菌菌株E. coli DH5α中的野生型fnr基因，得到正丁醇耐受性提高的大肠杆菌菌株E. coli DH5α fnr::fnr1和E. coli DH5α fnr::fnr2。

本发明的有益效果是：通过对大肠杆菌菌株中的野生型fnr基因的碱基替换，影响其所调控的各种基因的转录水平，调节整个菌体的代谢网络，进而提高大肠杆菌的正丁醇耐受性，对利用大肠杆菌用于工业化生产正丁醇具有重要的意义。

附图说明

图1：重组载体pKSC-fnr结构示意图；

图2：本发明菌株E. coli DH5α fnr::fnr1和E. coli DH5α fnr::fnr2在1.0 % (v/v)正丁醇中生长情况图。

具体实施方式

该野生型fnr的DNA序列及多肽序列分别在SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2中给出。

本发明是一种提高大肠杆菌正丁醇耐受性的方法，包括以下步骤：

1、将大肠杆菌菌株E. coli DH5α中的野生型fnr基因克隆到pKSC质粒上，得到重组载体pKSC-fnr，野生型fnr基因的序列如SEQ ID NO.1所示，野生型fnr的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，pKSC质粒的序列如SEQ ID NO.3所示，重组载体pKSC-fnr的序列如SEQ ID NO.4所示；