[发明专利]一种嗜热栖热菌漆酶及工程菌、重组漆酶和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域和环境生物领域，特别涉及一种嗜热栖热菌漆酶基因和该基因工程菌和该基因编码的漆酶在生物酶法处理纺织废水中的应用。

背景技术

漆酶(benzenediol:oxygen oxidoreductases,EC1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶，属于蓝色多铜氧化酶(MCOs)家族，广泛分布在植物、真菌、少数细菌和昆虫中。漆酶的活性中心一般包含4个铜离子，漆酶的催化氧化反应即通过铜离子间的协同传递电子，夺取反应底物的电子，将底物氧化为自由基形式，同时将从底物捕获的电子传递给O₂，将O₂还原为水。漆酶作用的底物相当宽泛，典型的底物是各种酚类化合物及其衍生物，包括简单的二酚、多酚、甲氧基取代酚(如愈创木酚)、氨基酚、氯酚等。在小分子的介体物质存在下，漆酶可氧化的底物范围还将进一步扩大。由于漆酶具有降解木质素与有毒酚类物质的作用，使得漆酶在工业上有重要的应用价值，包括工业染料脱色、土壤和水体的生物除污、纸浆漂白、食品和果汁加工等方面。

目前研究比较多且深入的漆酶大多是真菌漆酶。但真菌漆酶的工作pH一般在酸性范围，热稳定性较差，而且对氯离子比较敏感，在高浓度氯离子环境下容易失去活性。这些缺点使真菌漆酶在某些工业应用领域受到一定的限制。而细菌漆酶的工作pH一般在中性到碱性范围，热稳定性好，且它们中有不少对氯离子有较高的耐受性。

印染、纺织工业的废水排放量巨大，而且未经处理的废水严重污染环境。来自印染、纺织工业的废水的pH值一般在中性到碱性，含有高浓度氯化物、金属离子、表面活性剂和合成染料等复杂成分。其中高含量的工业染料可能对水体生物具有毒性，降低水体能见度，同时增加水体生物需氧量(BOD)。大部分的工业染料都难以被微生物降解，使用物理或者化学方法往往成本高而且效果不佳。生物法，比如利用漆酶、锰过氧化物酶等，对一些工业染料的脱色率高且环保。

因此，具有碱性工作pH以及对高浓度氯化物具有高耐受性的细菌漆酶在印染、纺织废水脱色处理中具有独特的优势。

发明内容

本发明的目的之一在于克服现有技术中的不足，提供一种来源于嗜热栖热菌Thermus thermophilus的漆酶基因。

本发明按照毕赤酵母密码子偏好性对漆酶基因进行优化，并通过全基因合成得到该漆酶基因核酸序列，该漆酶基因的核酸序列如Seq No.1所示,氨基酸序列如Seq No.2所示。该漆酶基因能够在毕赤酵母(Pichia pastoris)实现高效表达。

上述漆酶基因在构建巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统中的应用，将上述漆酶基因及其调节基因构成的表达盒整合到毕赤酵母的基因组中，具体包括如下步骤：

(1)将权利要求2所述DNA连入到巴斯德毕赤酵母表达载体pHKFA1，得到表达载体pHKFA1-lacTT；

(2)通过将表达载体pHKFA1-lacTT化学转化E.coli Top10得到克隆菌株E.coli Top10/pHKFA1-lacTT。

一种重组毕赤酵母工程菌，将权利要求5所述表达载体pHKFA1-lacTT线性化后转化毕赤酵母(Pichia pastoris)获得。

上述重组毕赤酵母工程菌的构建方法如下：

将表达载体pHKFA1-lacTT经Kpn2I单酶切线性化并纯化后电转化毕赤酵母工程菌(Pichia pastoris)GS115感受态细胞，并在MD平板进行阳性转化子筛选；以MD平板筛选得到的转化子为模板，以TTF和TTR为引物进行PCR鉴定，PCR鉴定正确的转化子为重组毕赤酵母工程菌Pichia pastoris GS115/pHKFA1-lacTT，其中TTF和TTR的序列如Seq No.3、4所示。

一种重组漆酶，将上述重组毕赤酵母工程菌进行发酵获得。其构建方法如下：