[发明专利]一种分析VDR基因多态性位点Cdx-2的方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种分析VDR基因多态性位点Cdx-2的方法及应用。

背景技术

维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)是介导活性维生素D—1,25(OH)₂D发挥生物效应的生物大分子，位于细胞膜或细胞核中。1,25(OH)₂D激素信号分子在靶细胞与VDR结合形成激素-受体复合物，该复合物作用于靶基因上的特定DNA序列，对结构基因的表达产生调节作用。因此，1,25(OH)₂D在维持机体钙-磷代谢，调节细胞增殖、分化等方面的重要作用是通过VDR介导实现的。

VDR基因上存在众多单核苷酸多态性位点(Single Nucleotide Polymorphisms,SNPs)，它们广泛分布于基因启动子、外显子和内含子等区域。这其中的一些SNPs可能通过各种机制影响VDR基因表达或蛋白质活性水平，从而影响到机体健康状况。

Rs11568820[美国生物信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)的SNPs编号]是位于VDR基因启动子上的一个SNP，并处于尾型同源盒转录因子-2(Caudal Type Homeobox Transcription Factor2,CDX-2，为一种小肠特异性同源盒转录因子)与VDR启动子结合的区域，故通常也叫Cdx-2位点。该位点多数情况下的等位基因为G，少数情况下为A。VDR上Cdx-2位点的A等位基因可促进CDX-2调节VDR启动子的活性而提高VDR基因转录，促进小肠钙吸收。AA基因型能降低骨质疏松、骨质疏松性骨折、原发性侏儒症的发病风险，而系统分析发现该位点AA基因型与肿瘤风险增加有关。因此，检测Cdx-2位点的基因型，对研究VDR相关的生物医学作用具有重要价值。

在众多分析SNP的实验技术中，聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)后的限制性酶切片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)分析(PCR-RFLP)通常是最为简单、有效的技术。但在目前知道的全部限制性内切酶中，仅有Bst4CI(或其同切口限制性内切酶HpyCH4III、Tsp4CI、TaaI)能够识别VDR基因Cdx-2位点所在的核苷酸序列(ACN^GT)，这类内切酶较不常用，且缺乏PCR扩增该目的片段的理想引物。同时，也尚未见到通过引物碱基替换引入其它酶切位点而实现分析的报道。因此，此前的研究者通过测序、探针杂交或高分辨率熔解曲线法(High Resolution Melting,HRM)分析等方法来检测该位点的基因型。

1.测序法。该技术是分析核苷酸(或碱基)种类及排列顺序的直观方法，需要PCR仪和测序仪等。通过PCR反应扩增含有VDR基因Cdx-2位点的核酸片段，再用测序仪判读该片段中依次排列的全部核苷酸种类，从测序报告中直接判定该DNA片段中Cdx-2位点的等位基因碱基。因测序原理的不同，可有不同的测序设备可选。如Illumina、ABI、Life Technology、Roche等等公司均有自己的品牌测序仪。这些测序设备通常含配套检测试剂，如ABI3100/3700系列的核酸序列检测仪，可结合ABI PRISM SNaPShot Multiplex试剂盒使用。测序设备价格相对较贵，大都在100万元以上，配套试剂也较为封闭。这类方法大致分析流程是：特异性引物扩增含SNPs目的片段的PCR反应—PCR产物纯化—纯化产物为模版的再次PCR扩增(如用特殊试剂盒ABI SNaPshot)—纯化PCR产物—测序—软件分析。