[发明专利]S腺苷同型半胱氨酸水解酶（SAHH）的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因重组S腺苷同型半胱氨酸水解酶（SAHH）的制备方法，具体地说，涉及一种在酵母中制备重组S腺苷同型半胱氨酸水解酶（SAHH）的方法。

背景技术

1、S腺苷同型半胱氨酸水解酶（SAHH，Adenosylhomocysteinase）

同型半胱氨酸（Hcy）为含巯基氨基酸，是体内甲硫氨酸循环过程中的一个代谢中间产物。血液中总Hcy浓度的病理性升高会导致高同型半胱氨酸血症。近年来的研究已确认，高同型半胱氨酸血症与作为人类第一杀手的动脉粥样硬化、高血压、心肌梗死等多种心血管疾病的发生有密切关系，是心血管疾病的一个新的独立和重要的危险因素。目前国内外已经把Hcy作为心血管疾病的一个检测指标。

Hcy检测方法中最快捷、灵敏度高、适合大批量样品检测，并且可以上生化分析仪自动分析的是Hcy检测试剂盒。其中最常用的是循环酶法试剂盒，试剂盒中最核心的酶是Hcy甲基转移酶（HMT）和S腺苷同型半胱氨酸水解酶。游离型Hcy与共价底物S-腺苷甲硫氨酸（S-Adenosyl Methionine，SAM）在同型半胱氨酸甲基转移酶（Homocysteine Methyltransferase，HMT）的催化下反应，形成甲硫氨酸（Met）和S-腺苷同型半胱氨酸（S-Adenosyl Homocysteine，SAH），SAH被S腺苷同型半胱氨酸水解酶水解成腺苷(Ado)和Hcy，形成的Hcy可以循环加入反应，从而放大检测信号。这些反应被用来研发同型半胱氨酸检测试剂盒。

2、基因重组方法制备SAHH

传统方法从动物体内提取SAHH具有难以克服的缺点，例如：得率很低；批间差很大；存在生物安全隐患，难于工业化生产等。而基因工程方法来表达，生产重组蛋白质不会存在这些问题。最常用的基因工程蛋白表达系统包括大肠杆菌和酵母系统。

（1）大肠杆菌表达系统

作为发展最早、目前应用最广泛的经典表达系统，大肠杆菌表达系统优点在于遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、表达产物容易纯化、稳定性好、抗污染能力强以及适用范围广等。但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：如目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难；而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。

（2）酵母表达系统

酵母表达系统作为一种后起的外源蛋白表达系统，由于兼具原核以及真核表达系统的优点，正在基因工程领域中得到日益广泛的应用。最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母。但与新型酵母体系相比，酿酒酵母表达系统存在不适合高密度培养、缺乏强有力的严格调控的启动子，而且分泌效率较低，尤其是许多分子量大于30kD的外源蛋白几乎不分泌等缺点，通常不被看作是重组蛋白的理想宿主。后来人们又相继开发了裂殖酵母、甲醇酵母等。

甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母主要有H Polymorpha，Candida Bodini，Pichia Pastris3种，并以Pichia Pastoris应用最多。甲醇酵母的表达载体为整合型质粒，载体中含有与酵母染色体中同源的序列，因而比较容易整合入酵母染色体中。大部分甲醇酵母的表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因(AOX1)，在该基因的启动子(PAOX1)作用下，外源基因得以表达。PAOX1是一个强启动子，在以葡萄糖或甘油为碳源时。甲醇酵母中AOX1基因的表达受到抑制，而在以甲醇为唯一碳源时PAOX1可被诱导激活，因而外源基因可在其控制下表达,将目的基因多拷贝整合入酵母染色体后可以提高外源蛋白的表达水平及产量。甲醇酵母一般先在含甘油的培养基中生长。培养至高浓度。再以甲醇为碳源。诱导表达外源蛋白。这样可以大大提高表达产量。利用甲醇酵母表达外源性蛋白质其产量往往可达克级。

国内外已有SAHH表达的文章和专利。徐明旭等人（高特异性活性重组S-腺苷高半胱氨酸酶的制备与高度表达及对S腺苷甲硫氨酸的改进分析，专利申请号：01803726.7）在大肠杆菌中表达了滴虫来源的SAHH基因。该基因表达产物含485氨基酸，大小为56kD左右。表达产物能特异地将S腺苷同型半胱氨酸水解为腺苷和同型半胱氨酸，具生物学活性。

金晓霞等人（黄瓜S-腺苷L-高半胱氨酸水解酶全长cDNA的克隆及表达分析）克隆了黄瓜SAHH cDNA基因，该基因编码485个氨基酸，分子量55kD左右。该基因和蛋白的生物学特征分析表明：该蛋白分别在85-99氨基酸和262-279氨基酸处各有一个SAHH活性功能区。但该文献未提及黄瓜SAHH在微生物中的表达。