[发明专利]用于检测活性氧的经修饰的结合核酸的花青染料

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年3月30日提交的美国临时申请系列号61/617,862的优先权权益，其通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明涉及可用于检测活性氧(ROS)的探针，特别是还原的结合核酸的花青染料探针，以及这样的探针在体外或在体内的用途。

背景技术

氧化性应激源于活性氧(ROS)的产生和细胞的清除这样的自由基的能力之间的失衡。氧化性应激可以由许多不同的固有和非固有途径造成，由线粒体呼吸或者由膜结合的NADPH氧化酶介导。ROS在几种疾病的进展中起重要作用，所述疾病包括、但不限于炎症、动脉粥样硬化、老化和年龄相关的变性障碍。可以检测血清样品、活组织外植体、细胞培养物中和体内的ROS的探针具有用于医学诊断和研究工具的潜在用途，用于诊断以ROS产生增加为特征的疾病。

成像术会实现在相同细胞中对与细胞毒性和细胞死亡相关的不同参数的多路分析、定位和定量。因此，通过常规荧光显微术、荧光光谱法、流式细胞计量术和/或高容量成像法来检测ROS，相对于其它技术而言可能是有利的。超氧化物和羟基自由基诸如二氢乙啶(DHE)的荧光传感器已经被用作ROS探针。但是，由于其自发性自氧化、快速光漂白、高毒性和与ROS的多种反应产物，DHE具有有限的适用性。此外，DHE的较低发射波长使得它的体内应用是有问题的。二氢罗丹明(DHR)是已经被研究用于检测ROS的另一种还原染料，其遭受高氧化速率，由此限制了它的应用。迄今开发的作为ROS探针的还原花青染料(其基于Cy3/Cy5/Cy7)在不同程度上遭受溶解度问题和/或自氧化。基于磺酸酯的染料也已经被研究用作ROS探针。这些探针(通常需要费时且昂贵的多步合成规程)会经历快速水解，由此限制了它们的应用。

因而，需要用于检测ROS的探针，其适合用于体外或体内应用，其不会遭受现有技术ROS探针的限制，诸如它们的发生由氧和/或光催化的自发性自氧化并伴随产生高水平的背景荧光的趋势。

发明内容

本文描述了通过例如常规荧光显微术、荧光光谱法、流式细胞计量术和/或高容量成像法来检测活性氧(ROS)的还原染料化合物、组合物、方法和试剂盒。本文中公开的还原染料化合物是新的还原的结合核酸的花青染料，所述染料是用于在体外或在体内在细胞中检测ROS和测量氧化性应激的探针。这些探针可以与其它活细胞染料一起用于多路应用中，使得它们可用于测量细胞毒性和细胞死亡的多种生物标志物，且可以用于评价由不同试剂在多种活细胞模型中产生的ROS，所述试剂包括、但不限于脂多糖、甲萘醌、血管紧张素II、奈法唑酮、离子霉素和谷氨酸盐。

与对应的氧化染料相比，本文中公开的还原的结合核酸的花青染料(其通常是膜可透过的且因此可以在细胞中积累)不能结合核酸并且几乎不表现出或根本不表现出荧光。在与ROS发生细胞内反应(即，检测ROS)以后，本文中公开的还原染料被氧化，由此提供以高亲和力结合核酸的花青染料，其在暴露于足够波长的光以后具有显著的荧光强度。图1显示了使用噻唑橙(TO)作为一个例子，用还原的结合核酸的花青染料进行细胞内ROS检测的示意图。还原的噻唑橙(还原的TO)跨过细胞膜以进入细胞，在此处它可以被ROS氧化以释放以高亲和力结合核酸的染料(TO)并发射亮绿色荧光。与例如针对线粒体膜电位、质膜渗透性和/或天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶活化的探针组合的本文中公开的还原染料也可以用于区分肝毒性化合物与无毒化合物。本文还描述了制备用在本发明的公开的组合物、方法和试剂盒中的新还原染料(即ROS探针)的方法。

在某些实施方案中，提供了具有结构式(I)的新还原染料化合物(即，ROS探针)：

其中