[发明专利]融合蛋白MBP-Eppin、蛋白Eppin及其制备方法

权利要求书

1.融合蛋白，命名为MBP-Eppin，其特征在于，蛋白MBP与蛋白Eppin之间插入有thrombin酶切，在蛋白Eppin的羧基端插入有组氨酸标签。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，编码该融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO3所示。

3.根据权利要求2所述的融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：

（1）大肠杆菌表达菌株Rossetta2-OrigamiB(DE3)的制备：扩大培养表达菌株Rossetta12(DE3)，提取其中的pRARE2质粒，转化于表达菌株OrigamiB(DE3)，从含有15μg/ml卡那霉素、12.5μg/ml四环素、34μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上挑取单克隆菌落扩大培养后制成表达菌株Rossetta2-OrigamiB(DE3)，保存于-80℃；

（2）Eppin基因克隆和表达载体的构建：从Eppin菌种中提取DNA作为模板，PCR扩增，将PCR产物回收、酶切、连接后，克隆到pMALc原核表达载体上，筛选所获得的阳性克隆，扩大培养后提取质粒pMALc-Eppin，PCR验证，测序，

所述PCR扩增时引物为：上游引物S1:5’CGGGATCCCCTGGTCTGACTGAT3’;

下游引物S2:5’CTAGCTAGCGGGAAAGCGTTT ATT3’；

（3）融合蛋白的诱导表达：测序正确的重组质粒pMALc-Eppin转化表达菌株Rossetta2-OrigamiB(DE3)，扩大培养后将菌液接种于的表达培养基中，37℃震荡培养至OD值为0.6，降温至22.5℃后按终浓度0.1mM加入IPTG诱导表达，22.5℃震荡培养过夜。离心，收集细菌沉淀，重悬于缓冲液1中，高压破碎菌，取诱导后上清液，

所述1升表达培养基的组成为15μg/ml卡那霉素+12.5μg/ml四环素+50μg/ml氨苄青霉素+34μg/ml氯霉素+10g蛋白胨+5g酵母+5g氯化钠+2g葡萄糖，其余部分是双蒸水；

所述缓冲液1为加入有500mM NaCl+20mM咪唑的50mM Tris-HCl，pH8.0。

4.根据权利要求3所述的融合蛋白的制备方法，所述制备方法还包括融合蛋白的纯化步骤，所述纯化步骤依次包括将上清液用Ni-NTA亲和层析柱纯化，和亲和层析柱的洗脱液于Superdex20016/60柱进行分子筛层析纯化。

5.根据权利要求4所述的融合蛋白的制备方法，所述Ni-NTA亲和层析柱进行纯化时用缓冲液1冲洗去其他蛋白后，用缓冲液2洗脱融合蛋白，所述缓冲液2为加入有500mMNaCl+20mM咪唑的50mM Tris-HCl，pH8.0。

6.根据权利要求5所述的融合蛋白的制备方法，所述分子筛层析纯化时用缓冲液3洗脱，所述缓冲液3为加入有500mM NaCl的50mM Tris-HCl，pH8.0。

7.蛋白Eppin的制备方法，包括如下步骤：

（1）获得权利要求1所述的融合蛋白MBP-Eppin，

（2）使用牛血清thrombin酶切，得到15kD左右的Eppin蛋白。

8.根据权利要求7所述的制备方法，所述融合蛋白MBP-Eppin采用权利要求3-6所述的制备方法获得。