[发明专利]一种丙型肝炎病毒（HCV）高精确核酸定量检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学临床诊断领域中的一种丙型肝炎病毒（HCV）高精确核酸定量检测试剂盒。

背景技术

丙型肝炎是全球最严重的公共卫生问题之一，丙型肝炎呈世界性分布。丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)感染率为0.1％～10％，平均为3％，全球约1.7～2亿人感染HCV。中国拥有世界上最多的慢性丙型病毒性肝炎（HCV）感染者，约3800万。丙型肝炎病毒感染发展为慢性感染的机率远远高于乙肝病毒感染，一般来说，HCV感染者中70～80％发展成慢性丙型肝炎，慢性丙型肝炎的表现亦轻重不等，约20～30％可逐渐发展至肝硬化，肝硬化患者中，每年约1％～4％可发展为肝癌。

酶联免疫试剂是目前诊断丙型肝炎的主要手段。针对HCV抗原，抗体而设计的酶联免疫试剂目前已经普遍用于临床，急诊，血液筛查等各个领域。但是，酶联免疫方法作为一种间接滞后的检测方法，他所检测的目标是人体内产生的抗体而不是病原体本身。因此，虽然酶联免疫方法经过几代的改良和进化，在灵敏度、特异性、精确度和稳定性等方面有了巨大的提高。但是仍（任）然不能消除对“窗口期”标本的漏检。所谓“窗口期”，是指从感染病原体开始，直至用酶联免疫学检测方法能够检测到该病原体存在为止的这一段时间。丙肝的“窗口期”比较长，大约为56-60天，因此，HCV酶联免疫试剂容易造成漏检，不利于丙肝的早期诊断。近年来核酸分子检测技术在检验医学和临床研究中显示出强大的优势，相比较免疫诊断技术具有灵敏度高、特异性强、诊断快速等优点。血清中的HCV RNA是病毒复制和肝炎进程的确切标志，所以血清中HCV RNA的检测，已成为诊断丙肝的“金标准”方法。近几年来，通过荧光定量PCR方法直接检测HCV RNA已经成为一种通用丙肝医学检测方法，大大提高了丙肝的检测准确性，有利于疾病的早期诊断，可将“窗口期”大大的缩短。目前，丙型肝炎荧光定量PCR检测目前已经是通过国家认证临床PCR实验室的常规检测项目之一。丙型肝炎荧光定量PCR检测在丙肝病人的康复治疗过程中具有用药指导意义，同时，丙肝病毒载量的精确判读，也为患者提供了准确的康复治疗方案。

近年来，相比于传统的病毒核酸提取技术，市场上涌现了一些简单方便的核酸提取技术。主要涉及两种类型技术：离心柱法病毒核酸提取技术和磁珠法病毒核酸提取技术。前者由于提取技术中的离心柱配套使用的高通量自动化离心设备成本过高，难于普及推广。磁珠法提取核酸是通过细胞裂解液裂解细胞，从细胞中游离出来的核酸分子被特异的吸附到磁性颗粒表面，而蛋白质等杂质不被吸附而留在溶液中。再在磁场作用下，使磁性颗粒与液体分开，回收颗粒（即磁珠-DNA混合物），再用洗脱液洗脱即可以得到纯净的DNA。磁珠法不需要加入多种试剂，操作简单，符合核酸自动化提取要求，是未来核酸纯化方法发展的一个重要方向。另外，磁珠提取核酸能够获得较高的回收产率。国内已有的HCV荧光定量PCR检测试剂不多，仅有3-4种，且均为离心柱法回收核酸。

目前市售的丙型肝炎病毒（HCV）核酸定量检测试剂盒还有很多缺点，其中之一就是使用的质控品和标准品是裸露的RNA片段，由于裸露的RNA片段极不稳定，因此导致试剂的稳定性和重复性比较差。同时，由于裸露的RNA片段与真实病毒差距过大，无法模拟真实病毒的提取状态。另外，也导致产品无法与国际标准血清盘进行溯源。因此，研究开发一种丙型肝炎病毒（HCV）高精确核酸定量检测的方法及其试剂盒是目前急待解决的新课题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种丙型肝炎病毒（HCV）高精确核酸定量检测的方法及其试剂盒，该发明从根本上解决现有丙型肝炎病毒（HCV）核酸定量PCR技术存在的灵敏度低、准确性差等问题，其设计的引物和TaqMan荧光探针位于HCV基因组的5’UTR区域，该引物和探针具有基因型覆盖范围广，检测灵敏度高，特异性强、稳定性好，应用磁珠法进行RNA提取，方法简单，核酸纯度高，提取样本可为血清或血浆，样本量大，采用内标和防污染体系提高检测精确度，采用耐DNase和RNase假病毒作为工作标准品和质控品，提高试剂盒的稳定性。