[发明专利]同时提高丹参中迷迭香酸和丹酚酸B含量的载体及其应用

权利要求书

1.一种同时提高丹参中迷迭香酸和丹酚酸B含量的载体，其特征在于所述载体具有如图4的结构示意图。

2.一种同时提高丹参中迷迭香酸和丹酚酸B含量的载体的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

 (1) 拟南芥PAP1转录因子和丹参COMT基因cDNA序列的克隆

合成AtPAP1转录因子的扩增引物，上游引物序列为

5’-AGATCTATGGAGGGTTCGTCCAAAGG-3’，下游引物序列为5’-GGTAACCCTAATCAAATTTCACAGTCTCTCC-3’；合成SmCOMT基因的扩增引物，上游引物序列为5’-GCTCTAGACTCGAGGGATCCGTGTGGTGGATGTTGGTGGAGGAATTG-3’，下游引物序列为5’-CCATCGATGGTACCATGTGGACAACATTCTTAGTGGCCAGC-3’； AtPAP1转录因子和SmCOMT基因的扩增引物分别以拟南芥和丹参cDNA为模板，经聚合酶链式反应扩增，获得的扩增产物进行电泳分离，将AtPAP1转录因子扩增产物通过双酶切与pMD19-T simple载体连接，将SmCOMT基因的扩增产物通过双酶切与pMD19-T simple植物表达载体连接，连接载体分别转入大肠杆菌DH5α中增殖；

(2) 构建过表达AtPAP1转录因子并同时RNA干涉SmCOMT基因的植物表达载体

用Bgl II和BstE II分别双酶切所述的连接AtPAP1转录因子的pMD19-T simple载体和pCAMBIA1302植物表达载体，回收连接转化，挑取单克隆，经菌落PCR检测筛选出阳性克隆，获得AtPAP1基因过表达重组质粒OEPAP1；用Xho I和Kpn I以及BamHI和Cla I分别双酶切所述的连接SmCOMT基因的pMD19-T simple载体，以相反的方向将正义链和反义链连接到中间载体pKannibal上，形成interference box，获得的RNA干扰COMT载体命名为pKan-COMTi；用Sac I和Pst I分别双酶切OEPAP1和pKan-COMTi，回收连接转化，挑取单克隆，经菌落聚合酶链式反应检测和提取质粒酶切验证，得到含有过表达AtPAP1转录因子并同时RNA干涉SmCOMT基因的植物表达载体。

3.同时提高丹参中迷迭香酸和丹酚酸B含量的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1) 制备含有同时提高丹参中迷迭香酸和丹酚酸B含量的载体的根癌农杆菌菌株

将所述的权利要求1所述的同时提高丹参中迷迭香酸和丹酚酸B含量的载体或者权利要求2的制备方法所制备的同时提高丹参中迷迭香酸和丹酚酸B含量的载体转化根癌农杆菌EHA105感受态细胞，挑取抗性单克隆进行菌落聚合酶链式反应检测，获得含有所述植物表达载体的根癌农杆菌菌株；

(2) 转基因丹参植株的获得

用所述的根癌农杆菌菌株转化丹参叶片，置于含有1 mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、0.1 mg/L α-萘乙酸、200 mg/L 头孢霉素和3 mg/L潮霉素的MS固体培养基上进行选择培养，长出抗性芽后将其转入含有3 mg/L潮霉素的1/2 MS培养基上生根，获得潮霉素抗性的再生丹参植株；采用AtPAP1转录因子扩增的特异性引物，对再生丹参植株基因组DNA进行聚合酶链式反应，紫外线下观察到747 bp目的条带的阳性株系即为转基因丹参植株；

(3) 实时荧光定量逆转录-聚合酶链式反应分别检测AtPAP1转录因子和SmCOMT基因在转基因丹参植株中的表达

用AtPAP1转录因子、SmCOMT基因和丹参持家基因β-actin的检测引物，以丹参各样品cDNA稀释50倍为模板，进行实时荧光定量逆转录-聚合酶链式扩增反应，用比较“2^-ΔΔCt”的方法分析AtPAP1转录因子和SmCOMT基因的相对表达量；

(4) 对获得的转基因丹参植株中迷迭香酸和丹酚酸B的含量进行高效液相色谱测定，筛选获得二者含量显著提高的转基因丹参植株

用Phenomenex硅胶基质C₁₈色谱柱，以质量分数为0.4 %的醋酸水溶液、乙腈和甲醇为流动相梯度洗脱，流动相梯度洗脱程序为0.01～5分钟，质量分数为0.4 %的醋酸水溶液体积由95 %降为90 %，乙腈体积由5 %升至10 %；5～25分钟，质量分数为0.4 %的醋酸水溶液体积由90 %降为67 %，乙腈体积由10 %升至30 %, 甲醇体积由0升至3 %；25～40分钟，质量分数为0.4 %的醋酸水溶液体积由67 %降为60 %，乙腈体积由30 %升至35 %，甲醇体积由3 %升至5 %，柱温30 ℃，流速1.0 mL/分钟，检测波长280 nm，进样量20 μL，迷迭香酸和丹酚酸B的含量分别由标准曲线回归方程Y=2×10⁶X+50974 (R=0.9998) 和Y=1×10⁶X-126458 (R=0.9999) 进行计算，式中X表示迷迭香酸或丹酚酸B的进样量，Y表示迷迭香酸或丹酚酸B的峰面积，R表示相关系数。