[发明专利]新型合成的EBV共识DNA序列分子及由此组成的疫苗

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术和免疫学技术领域，尤其涉及到EBV病毒表达蛋白EBNA1、LMP1和LMP2的共识序列克隆、密码子优化表达、以及注射并进入哺乳动物组织细胞内的免疫方法，以达到诱导机体免疫反应。产生细胞和体液免疫对抗EBV病毒感染或清除已感染的细胞或含EBV病毒蛋白的癌变细胞。 

背景技术

在发达国家Epstein-Barr病毒（EBV）引起超过90%的传染性单核细胞增多症（IM）。EBV通常通过口腔分泌物传播，感染在咽喉部的B细胞，感染初期通常无症状或非特异性症状。然而，感染青少年或青年可导致IM，最新血清学研究显示75%EBV阳性患者可导致IM。 

EBV感染与多种肿瘤有关。据统计，全世界每年约有84000例EBV相关的胃癌，78000例EBV相关的鼻咽癌，28000例EBV相关的霍杰金淋巴瘤（Fukayama M. Pathol Int 60:337-50, 2010. Parkin DM. Int J Cancer 118:3030-44, 2006)。在中国南部地区50岁男人患鼻咽癌的几率是50/100,000 (de-The G. Epidemiology and control. New York: Plenum Medical Book Co.; p.935-67,1997)，鼻咽癌在北非也很普遍。EBV也与其它肿瘤相关，比如鼻部NK/T细胞淋巴瘤和外周T细胞淋巴瘤。 

EBV与免疫抑制病人的多种肿瘤发生相关，在器官移植病人中EBV淋巴瘤是继皮肤癌后最常见的肿瘤。 

EBV具有高度种属特异性，仅感染人类。初步试验研究发现狨猴也易于感染EBV患EBV淋巴瘤。以EBV主要糖蛋白gp350免疫狨猴可保护狨猴在EBV接种挑战后不患EBV B细胞淋巴瘤。 

EBV的gp350具有抗原性，可用来作为疫苗预防EBV感染和IM。EBV编码多种蛋白质，这些蛋白质也可作为CD4和CD8 T细胞的靶标。目前仍不十分清楚哪几种EBV病毒蛋白作为抗原（疫苗）可用来预防和治疗EBV相关的肿瘤。在EBV相关的肿瘤中，可检测到三种EBV蛋白质的表达，它们分别是EBNA1、LMP1和LMP2(Cohen JI et al. Sci Transl Med, 3: 107fs7, 2011)。最近研究证明，利用来源于这三种蛋白的不同多肽或多肽重叠作为抗原诱导动物产生免疫反应，从而筛选抗原簇用来作为鼻咽癌的免疫治疗。 

基因(DNA)疫苗是一种新型疫苗，由含编码病原体或癌症抗原片段的质粒所组成，能使机体不但产生体液免疫(抗体)反应，而且能产生细胞(T细胞)免疫细胞，具有预防和治疗效果。与传统疫苗相比，DNA疫苗有如下优点：1)良好的安全性; 2)易于生产，大大缩短了生产时间和降低了生产成本; 3)优越的稳定性，易于分销和长期贮存。目前有上百种DNA疫苗正在临床试验，比如宫颈癌DNA疫苗和通用大流感DNA疫苗均在临床二期。 

DNA疫苗的关键是如何使DNA分子大量进入细胞内，从而表达抗原蛋白，诱导产生细胞和体液免疫反应。人们一直在寻找新的方法使其顺利导入细胞。这些方法包括使用病毒或细菌载体、各种化学制剂如脂质体、物理方法如超声、激光、和电脉冲导入等。以病毒或细菌作为载体的转染导入方法，虽然效率高， 但会使机体产生对载体的免疫反应，从而使再次转染导入降低。化学制剂脂质体的导入效率有限，超声和激光方法， 目前仍然不够成熟。体内电脉冲导入是目前使用较为广泛的方法。 

发明内容

在EBV相关的肿瘤细胞中，可检测到EBV的三种蛋白质： EBNA1、LMP1和LMP2。来源于这三种蛋白的多肽或蛋白片段可诱导T细胞和B细胞免疫反应（Cohen JI et al. Sci Transl Med 3:107fs7,2011; Li W et al. Protein Pept Lett 20:1136-43,2013; Jones K et al. Blood 116:2245-52,2010)。本发明利用不同EBV病毒株的EBNA1、LMP1和LMP2蛋白质序列找出每一种蛋白质的共识序列作为抗原诱导抗体产生免疫反应来对抗来自不同EBV病毒株的感染或消灭不同EBV病毒株相关的肿瘤细胞。