[发明专利]一种抗人A组轮状病毒的鸡卵黄抗体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及卵黄抗体，尤其是一种高效价抗A组轮状病毒的鸡卵黄抗体及其制备方法和在预防和治疗轮状病毒感染中的应用。

背景技术

人A组轮状病毒（Rotavirus, RV）是引起婴幼儿感染性腹泻疾病的主要原因，其发病率高、危害严重，严重影响了婴幼儿的发育、营养要求和生存质量[Parashar UD等，2003；阳艳丽等，2011]。无论在发达国家还是发展中国家，轮状病毒所致的胃肠炎都是一个严重的公共卫生问题，该病毒所致的腹泻普遍流行，好发于秋冬季节，几乎所有5岁以下的儿童均发生过RV感染。据估计，每年因轮状病毒感染导致的门诊病例有2500多万人，住院病例200多万人[Tate JE等，2012]，就2004年轮状病毒致死人数据估计达到52.7万（47.5万-58.0万），并且主要发生在低收入国家。

目前，仍然缺少抗轮状病毒的特效药物。临床上一方面纠正水电解质平衡，另一方面以微生态制剂为主要组分的妈咪爱和以蒙脱石为主要组分的思密达进行治疗，但均不能对轮状病毒引起的婴幼儿腹泻进行有效预防和治疗，甚至滥用抗生素加剧肠道菌群的紊乱，进一步引起药物较难控制的肠炎。目前使用的主要是轮状病毒活疫苗，由于该疫苗有增加肠套叠风险和免疫保护局限等问题，致使该疫苗对轮状病毒引起腹泻的预防在发展中国家推广受阻【Patel NC等，2010；Patel MM等，2011；Vesikari T等，2012】。因此研发一种高效安全，易于服用的抗体疫苗，是本病防治急需解决的问题。

卵黄抗体（immunoglobulin yolk, IgY），即产蛋鸡经特定抗原免疫后，产生相应特异性抗体，并转运、储存于卵黄中，形成卵黄抗体。卵黄抗体相当于人的IgG，抗体亲和力比较高。特异性lgY通过与病原的结合，抑制病原菌的生长、运动和粘附作用。卵黄技术近年获得快速发展，在医疗领域具有良好的应用前景[Dias da Silva W等，2010]。IgY已经显示出较好的抗细菌、真菌和病毒效果。口服IgY已被证明能有效替代抗生素治疗因耶尔森菌、肠毒性大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、幽螺杆菌、轮状病毒等感染引起的胃肠道疾病。在我国，lgY在兽药领域获得生产批文的已达到10个，同时已有很多添加lgY的功能性保健食品和卫生消毒产品等上市销售，lgY技术在医疗诊断及治疗通过临床验证已显示出良好效果。

对于轮状病毒的卵黄抗体及相关产品，中国专利申请CN1201693A和CN1435260A均公开了采用野生型轮状病毒株，对其进行病毒细胞培养、病毒纯化和灭活，而制备成灭活病毒苗，通过免疫产蛋鸡获得相应的卵黄抗体。然而，灭活疫苗具有生产要求高、存在灭活不彻底和散毒的危险，同时，由于病毒残存等因素，这些都会对后期卵黄抗体的纯化带来困难。

发明内容

针对以上不足和缺陷，本发明的目的是提供一种抗A组轮状病毒鸡卵黄抗体制备方法。

本发明根据现代分子免疫学理论，分析并选择轮状病毒的主要抗原表位决定簇肽段VP7和VP8作为免疫原，采用基因工程技术实现在体外大量表达轮状病毒VP7和VP8抗原，将纯化的抗原与适宜的佐剂制备成疫苗免疫产蛋鸡，采用常规水稀释-硫酸铵沉淀-超滤法提取高效价的轮状病毒VP7和VP8的卵黄抗体。

本发明的另一目的是提供抗人A组轮状病毒的鸡卵黄抗体在预防和治疗轮状病毒感染中的应用。

本发明采用的技术方案为：

一种抗人A组轮状病毒鸡卵黄抗体的制备方法，包括：体外表达纯化人A组轮状病毒结构蛋白VP7或VP8，并免疫产蛋鸡，收集鸡蛋，分离纯化出VP7或VP8卵黄抗体。

优选一种抗人A组轮状病毒鸡卵黄抗体的制备方法，包括：PCR扩增人A组轮状病毒的结构蛋白VP7或VP8 DNA序列，将得到的VP7或VP8 DNA序列克隆到原核表达载体pET28a(+)上并转化大肠杆菌表达菌株BL21，诱导表达和纯化VP7或VP8重组蛋白，将VP7或VP8重组蛋白按照体积比1:1与弗氏佐剂混合乳化，肌肉或皮下注射免疫产蛋鸡，每隔一个月加强免疫一次，共2次，第3次免疫后一周开始收集鸡蛋，从蛋黄中分离纯化出抗轮状病毒结构蛋白VP7或VP8的特异性卵黄抗体。

更优选的一种抗A组轮状病毒鸡卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：