[发明专利]检测花生过敏原用扩增内标、其构建方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测花生过敏原用扩增内标、其构建方法及其应用。

背景技术

由于食品成分及其加工的复杂性，在DNA提取中残留的某些杂质成分对PCR扩增可能产生抑制作用，除抑制剂以外，其他原因主要有PCR仪故障、PCR检测体系不恰当、DNA聚合酶失活以及人为操作失误等，可能导致PCR检测出现假阴性结果，这会使得花生过敏患者误食含有花生成分的食品，造成食品安全问题，危害公众健康，因而需要绝对避免。在PCR反应体系中加入扩增内标（internal amplification control，IAC）是指示假阴性结果的有效手段之一，近年来已经成为PCR检测标准化的趋势。

扩增内标（Internal Amplification Control，IAC）是添加到PCR反应体系中用以指示假阴性现象的一段人工构建的DNA序列。其作用原理是：将扩增内标添加到PCR反应体系中，使之与目标基因序列共同进行扩增，如果在反应体系中存在一些抑制因素，则扩增内标和目的序列的扩增反应都将受到抑制，从而达到指示PCR反应假阴性的目的。从扩增内标与目的序列在扩增时是否存在竞争性的角度，扩增内标可分为两类：竞争性扩增内标与非竞争性扩增内标。竞争性扩增内标是指在同一PCR反应体系中与目的基因序列共用同一对引物进行扩增反应的一段基因序列。非竞争性扩增内标则是指在PCR扩增反应中不与目的基因序列共用同一对引物的一段序列。用竞争性扩增内标可以避免在同一PCR检测体系中使用多对引物，进而可以避免引物间的相互作用。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种检测花生过敏原用扩增内标。

本发明的目的之二在于提供该扩增内标的构建方法。

本发明的目的之三在于提供使用该扩增内标在检测花生过敏原中的应用。

假阴性是指由于PCR反应体系中存在抑制因素及其他相关原因致使原来应该为阳性的结果却呈现阴性的现象。扩增内标（Internal Amplification Control，IAC）是添加到PCR反应体系中用以指示假阴性现象的一段人工构建的DNA序列。在PCR反应体系中加入扩增内标是指示假阴性结果的有效手段之一，因为将扩增内标添加到PCR反应体系中，使之与目标基因序列共同进行扩增，如果在反应体系中存在一些抑制因素，则扩增内标和目的序列的扩增反应都将受到抑制，从而达到指示PCR反应假阴性的目的。实验结果表明，通过复合引物技术构建扩增内标，以及确定扩增内标在PCR体系中的添加量，可以检测食品中的花生成分。本发明在上述基础上完成。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种检测花生过敏原用扩增内标，其特征在于该扩增内标基因的序列为SEQ ID NO.1所示的碱基序列。

一种构建上述的检测花生过敏原用扩增内标的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

a. 通过BLAST比对，选择与花生过敏原Ara h 1基因同源性较低的单增李斯特菌FSL R2-561基因（NC_017546）作为内参基因，根据内参基因的序列设计引物，选择扩增产物比目的片段大150bp ~ 250bp的引物FSL-F/R；所述的花生过敏原Ara h 1的基因为：

Ara h 1-F：CTGGAAACCTTGAACTCGT，

Ara h 1-R：GTTGATGGCTACTGGATGA；

所述的内参基因FSL R2-561的引物序列为：

FSL-F：TAGCCAACCGATGTTTCTGTATC，

FSL-R：CATCATTTAGCGTGACTTTCTTTCA；

b. 选取步骤a所得的内参基因的引物FSL-F/R的5’末端的8个碱基与花生过敏原引物Ara h1-F/R的3’末端相连，得到27bp的长引物IAC-F/R，该长引物的序列为：

IAC-F：CTGGAAACCTTGAACTCGTTAGCCAAC，

IAC-R：GTTGATGGCTACTGGATGACATCATTT；

c. 以步骤a所得内参基因FSL R2-561基因为模板，以步骤a所得FSL-F/R为引物，进行PCR扩增，得到351bp的PCR产物；以该PCR产物为模板，步骤b所得长引物IAC-F/R为引物，进行PCR扩增，得到389bp的PCR产物即IAC片段；