[发明专利]提取乳酸菌基因组DNA的试剂盒及相应的提取方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种DNA的提取试剂盒及相应的提取方法，具体涉及一种提取乳酸菌基因组DNA的试剂盒及相应的提取方法。 

背景技术

乳酸菌是一群形态代谢性能和生理学特征不完全相同且能发酵碳水化合物产生乳酸的革兰氏阳性细菌。目前在自然界中已发现的乳酸菌在细菌分类学上可以划分为43个属，包括373 个种及亚种，其中绝大多数是厌氧菌或兼性厌氧菌。人类对乳酸菌的分类鉴定和利用已经有久远的历史，并积累了丰富的经验和知识，形成了至今一直沿用的传统分类鉴定方法，包括形态特征、生理生化反应及血清学反应等，这些方法都是基于微生物表面受体的特异性，属于表型分类法。 

随着科技的进步，分子生物学方法以其较高的准确性及稳定性等优点逐步替代传统的形态学和生理学检测方法，并已成功介入到益生菌的鉴定领域。由于乳酸菌的细胞壁厚，肽聚糖含量较高，交联程度大，细胞裂解困难等问题，因此提供一种高效的提取乳酸菌基因组DNA的方法及其试剂盒具有非常重要的意义。 

发明内容

本发明要解决的技术问题，是提供一种提取乳酸菌基因组DNA的试剂盒及相应的提取方法，试剂盒包括 Buffer-1～Buffer-6，以及其它试剂，组成简单，成本低；其相应的提取方法操作简单、方便，成本低，适用于乳酸菌多样性分析时，大量常规样品的乳酸菌基因组DNA提取。 

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是： 

一种提取乳酸菌基因组DNA的试剂盒，它包括以下试剂：

 Buffer-1为质量百分比为10%的十二烷基硫酸钠溶液；

  Buffer-2为150～200mg/mL 的溶菌酶，用无菌水配制；

  Buffer-3为15～20mg/mL的蛋白酶K，用20mM Tris-HCL配制，其pH值为7.5；

  Buffer-4为10mol/L CTAB，由4.1g NaCl溶于80mL水中，再缓慢加入10g CTAB 配制而成；

  Buffer-5为5M NaCl溶液；

  Buffer-6为10mM Tris-HCl，1 mM EDTA，0.1mg/mL RNaseA；

其它试剂：体积比为25:24 :1的苯酚：氯仿：异戊醇混合的抽提液；

  异丙醇；

  体积百分比为70%的乙醇。

本发明还提供了相应的提取乳酸菌基因组DNA的方法，它按照以下步骤顺序进行： 

（1）取对数生长期的乳酸菌菌液3mL，于12000rpm离心1min收集菌体，菌体用Buffer-6洗涤两次，后用500μL Buffer-6重悬菌体，得菌体悬浊液1；

（2）将菌体悬浊液1中加入50μL Buffer-1和20μL Buffer-2溶液，37℃，温箱温育1h，裂解细胞壁，得菌体悬浊液2；

（3）将菌体悬浊液2中加入10 μL Buffer-3，混匀后于55℃温箱过夜消化，使蛋白变质或降解，得菌体悬浊液3；

（4）将菌体悬浊液3中加入100μL Buffer-4和100μL Buffer-5溶液，混匀，65℃水浴加热15min，沉淀蛋白，得菌体悬浊液4；

（5）用等体积的抽提液将菌体悬浊液4抽提基因组DNA，除去蛋白，12000rpm离心10min，取上清液，得上清液5，再使用等体积的抽提液将上清液5抽提基因组DNA，除去蛋白，12000rpm离心10min，取上清液，得上清液6；

（6）将上清液6用0.8倍体积的异丙醇沉淀基因组DNA，得沉淀7； 

（7）沉淀7用70%乙醇洗涤沉淀2次，抽干后用30 μL Buffer-6溶解沉淀，最终得乳酸菌基因组DNA溶液。

由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于： 

    针对乳酸菌细胞壁厚、肽聚糖含量高、交联程度大以及细胞裂解困难的问题，本发明提供了一种高效稳定提取乳酸菌基因组DNA的试剂盒及其提取方法，操作简单、方便，成本低，适用于乳酸菌多样性分析时，大量常规样品的乳酸菌基因组DNA提取，提取浓度高，所提取的DNA浓度90～373ng/μL，DNA纯度较好，其OD₂₆₀/OD₂₈₀值在标准范围1.70-1.90之间。

本发明适用于提取乳酸菌基因组DNA。 

本发明下面将结合说明书附图与具体实施例作进一步详细说明。 

附图说明