[发明专利]一种用于检测EGFR基因热点突变的试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测EGFR基因热点突变的试剂盒及其检测方法。

背景技术

EGFR（epidermal growth factor receptor）即表皮生长因子受体，正常情况下包埋在细胞表面的细胞膜中，是一种对肿瘤细胞的繁殖、生长、修复和存活等起重要作用的膜蛋白。

目前临床上治疗癌症的部分靶向药物如单抗类药物（爱必妥Eribtux、西妥昔单抗Cectibix/帕尼单抗Panitumumab）、小分子类药物（易瑞沙Iressa/吉非替尼Gefitinib、特罗凯Tarceva/尼罗替尼Erlotinib），通过阻断EGFR的活性抑制其磷酸化和信号传导，从而起到抗肿瘤作用，同时也能增加化疗和放疗的抗肿瘤疗效。

易瑞沙和特罗凯是近年来开发的两种特异性较高的治疗非小细胞肺癌的肿瘤靶向治疗药物，它们都属于表面生长因子受体（EGFR）-络氨酸激酶抑制剂（TKI）类药物，该类药物通过抑制肿瘤发生、发展中必须的表皮生长因子受体络氨酸激酶活性而阻断肿瘤细胞的信号传导，抑制肿瘤细胞的增生、侵袭、转移、血管生成并促进肿瘤细胞的凋亡。

临床实践显示易瑞沙和特罗凯这两种药物疗效存在很大的个体差异，仅有25%-35%的个体很有很好的效果。研究发现，EGFR基因络氨酸激酶区域存在多种突变，这些突变主要集中在外显子18～21上，其中以19号外显子内缺失突变以及21号外显子L858R最为常见，这些突变能够很好地预测易瑞沙和特罗凯的治疗效果，为肿瘤用药提供指导依据。

目前用于基因突变检测的方法有Sanger测序法、高效液相色谱法、实时荧光定量PCR法等。Sanger基因测序技术经过了30年的不断发展与完善，现在已经可以对长达1,000bp的DNA片段进行测序，而且对每一个碱基的读取准确率高达99.999%。由于具有很高的读取准确率，Sanger法测序成为基因突变、单核苷酸多态性等基因分析的金标准。

肿瘤组织中，EGFR野生型细胞与突变型细胞混杂，而Sanger测序法的灵敏度仅为10～20%，即当突变型细胞占整体检测细胞的10～20%时才能检出，因此而极大的限制了Sanger测序法的应用。

肽核酸（peptide nucleic acids，PNA)一类以多肽骨架取代糖磷酸主链的DNA类似物。它是在第一代、第二代反义试剂的基础上，通过计算机设计构建并最终人工合成的第三代反义试剂，是一种全新的DNA类似物，即以中性的肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键取代了DNA中的戊糖磷酸二酯键骨架，其余的与DNA相同，PNA可以通过Watson-Crick碱基配对的形式识别并结合DNA或RNA序列，形成稳定的双螺旋结构。由于PNA不带负电荷，与DNA和RNA之间不存在静电斥力，因而结合的稳定性和特异性都大为提高；不同于DNA或DNA、RNA间的杂交，PNA与DNA或RNA的杂交几乎不受杂交体系盐浓度影响，与DNA或RNA分子的杂交能力远优于DNA/DNA或DNA/RNA，表现在很高的杂交稳定性、优良的特异序列识别能力、不被核酸酶和蛋白酶水解。并且PNA与互补DNA具有1个碱基不匹配时，其溶解温度会下降8℃～20℃，2个碱基不匹配时则完全不能杂交。鉴于上述诸多DNA分子不具备的优点，近十年来，人们为其在许多高技术领域找到了用途。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种用于检测EGFR基因热点突变的试剂盒及其检测方法，本发明采用PNA钳夹技术封闭野生型EGFR基因序列，从而提高检测EGFR基因热点突变的敏感度和突变检出率。

为解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：