[发明专利]一种用于检测EGFR基因热点突变的试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种用于检测EGFR基因热点突变的试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液、PCR引物、探针、PNA试剂、酶消化液、测序反应液、磁珠和产物纯化液，所述PCR反应液包含PCR缓冲液、dNTPs和DNA聚合酶，所述PCR引物包括4对相互独立的引物，第一对引物的正向引物序列为SEQ.ID NO.1，反向引物序列为SEQ.ID NO.2，第二对引物的正向引物为SEQ.ID NO.3，反向引物为SEQ.ID NO.4，第三对引物的正向引物为SEQ.ID NO.5，反向引物为SEQ.ID NO.6，第四对引物的正向引物为SEQ.ID NO.7，反向引物为SEQ.ID NO.8；所述探针包括4组相互独立的探针，第一组探针的序列为SEQ.ID NO.9，第二组探针的序列为SEQ.ID NO.10，第三组探针的序列为SEQ.ID NO.11，第四组探针的序列为SEQ.ID NO.12，所述四组探针的5’端的荧光基团均为FAM，3’端的荧光基团均为BHQ1；所述PNA试剂包含五组相互独立的PNA试剂，第一组PNA试剂中PNA序列为SEQ.ID NO.13，第二组PNA试剂中PNA序列为SEQ.ID NO.14，第三组PNA试剂中PNA序列为SEQ.ID NO.15，第四组PNA试剂中PNA序列为SEQ.ID NO.16，第五组PNA试剂中PNA序列为SEQ.ID NO.17；所述测序反应液中含有Bigdye、Bigdye缓冲液和测序引物。

2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述PCR缓冲液由100mmol/L Tris-HCl、500mmol/L KCl和15mmol/L MgCl₂组成；所述dNTPs的摩尔浓度为2.5mmol/L dNTPs；所述DNA聚合酶的酶活力单位浓度为5U/μl；所述4对相互独立的引物，每对PCR引物中均含有10μmol/L PCR正向引物和10μmol/L PCR反向引物；所述4组相互独立的探针，每组探针的摩尔浓度均为10μmol/L；所述五组相互独立的PNA试剂，每组PNA试剂中PNA序列的摩尔浓度均为10μmol/L。

3.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于所述酶消化液包括核酸外切酶Ⅰ和碱性磷酸酶。

4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于所述核酸外切酶Ⅰ和碱性磷酸酶的酶活力单位比为5：2。

5.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述测序反应液含有5×Bigdye、2.5×Bigdye缓冲液和3μmol/L的测序引物。

6.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于所述产物纯化液为0.75M氯化钠溶液。

7.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于在所述4对PCR引物的正向引物的5’端均插入通用M13序列：TGTAAAACGACGGCCAGT，在所述4对PCR引物的反向引物的5’端插入通用M13序列：CAGGAAACAGCTATGACC，则所述的测序引物序列为：TGTAAAACGACGGCCAGT。

8.一种使用权利要求1～7所述试剂盒检测EGFR基因热点突变的方法，其特征在于它包括如下步骤：

（1）目的基因荧光定量PCR扩增：使用试剂盒中的PCR反应液、PCR引物、探针和PNA试剂，对样品DNA进行PCR扩增反应，得到目的基因的荧光定量结果和PCR产物；

（2）根据步骤（1）中的定量结果，使用试剂盒中的酶消化液，对步骤（1）得到的PCR产物进行纯化，得到纯化后PCR产物；

（3）使用试剂盒中的测序反应液，对步骤（2）得到的纯化后PCR产物进行测序PCR反应，得到测序PCR产物；

（4）使用试剂盒中的磁珠和产物纯化液，对步骤（3）得到的测序PCR产物进行纯化，得到纯化后测序PCR产物；

（5）将步骤（4）得到的纯化后测序PCR产物加样至测序仪进行序列分析，测序所得基因序列与EGFR基因标准序列进行比对，并查看峰图，判断是否存在EGFR基因热点突变。