[发明专利]检测汞离子的间接竞争酶联免疫试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及酶联免疫和离子检测，特别是涉及一种用于检测汞离子的间接竞争酶联免疫试剂盒及其制备方法。 

背景技术

汞，俗称水银，是在常温、常压下唯一以液态存在的金属，化学性质稳定，汞常温下即可蒸发，汞蒸汽和汞的化合物多有剧毒。汞在自然界中普遍存在，我国是汞的生产、使用和排放大国，汞污染防治形势十分严峻。重金属汞是环境污染持久的剧毒物质，毒性高，损害人类健康，汞污染已成为全球性的重大环境问题，亦引起我国政府的高度重视，汞污染防治已被列为“十二五”规划重大专项。汞中毒以慢性为多见，主要是在生产或使用过程中长期吸入汞蒸汽和汞化合物粉尘所致。汞蒸汽较易透过肺泡壁细胞膜，与血液中的脂质结合，很快分布到全身组织。汞在红细胞和其它组织中被氧化成Hg²⁺，并与蛋白质结合而蓄积。金属汞在胃肠道几乎不吸收。慢性汞中毒主要症状表现为精神异常、齿龈炎、震颤和肾炎等；急性汞中毒主要表现为急性腐蚀性口腔炎和胃肠炎，严重时可发生急性肾功能衰竭、肝脏损害。皮肤接触汞及其化合物可引起接触性皮炎，具有变态反应性质。 

由于汞的污染和危害性较大，我国制定了土壤、食品、水体、化妆品等涉汞领域中的国家限量标准，食品中牛乳汞允许量标准（GB2762-94）为≤0.01mg/kg，地下水质量标准（GB7468-2012）中规定，主要适用于集中式生活饮用水水源及农田灌溉水的汞离子限量≤0.001mg/L。 

目前，检测环境汞离子的方法主要有（1）物理和化学分析方法，包括分光光度法、原子吸收光谱法（AAS）、电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）、电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES）、原子荧光光谱法（AFS）等。这些方法各有优缺点，分光光度法操作简单，快速，干扰小，但其灵敏度不高；原子吸收光谱法、电感耦合等离子体质谱法、电感耦合等离子体原子发射光谱法、原子荧光光谱法具有选择性好、测定精度高、简单、快速等优点，但所用仪器比较昂贵，只能在实验室进行检测，且对操作人员技术要求较为严格，限制了其广泛使用。（2）免疫学分析法：包括酶联免疫吸附法（ELISA）和胶体金免疫层析法。酶联免疫吸附法（ELISA）以竞争性酶联免疫反应为检测原理，反应显色后用酶标仪测定吸光值（OD）值进行结果判定，该方法缩短了检测时间，可以对重金属进行定性定量检测。但ELISA方法需要配套的酶标仪和配套试剂，操作过程较复杂，而且国内现处在研发阶段，进口国外产品价格昂贵，因而ELISA方法的应用受到了较大限制。而商品化的快速检测仪器，其灵敏度低（检测下限为0.1mg/L），达不到国标规定的限值（污水0.05mg/L，饮用水0.001mg/L），且选择性差，无法满足灵敏、准确的检测要求。 

因此，研究一种可以简便、敏感、特异、经济、筛检量大的汞离子快速检测产品，是当前迫切需要解决的技术问题，对于减少环境污染、保障食品安全具有重要意义。 

发明内容

本发明要解决的技术问题：针对现有检测汞离子技术的不足，制备出抗汞离子的高敏感性、高亲和力、高特异性的单克隆抗体，以此为基础制备用于检测汞离子的间接竞争酶联免疫试剂盒及其组建方法，该试剂盒能够快速、简便、敏感、特异的检测样品中的汞离子。 

本发明的技术方案： 

一种检测汞离子的间接竞争酶联免疫试剂盒，包括盒体，盒体内设有用汞离子包被抗原包被过的酶标板、抗汞离子的单克隆抗体、酶标二抗、底物显色液、终止液、汞离子标准溶液、洗液浓缩液和样品处理液。

所述酶标二抗为羊抗鼠酶标二抗GaMIgG-HRP或兔抗鼠酶标二抗RaMIgG-HRP，浓度均为100 ng/mL；所述底物显色液由显色剂A和显色剂B组成，显色剂A为过氧化脲，显色剂B为四甲基联苯胺（TMB）；所述终止液为2 mol/L的硫酸溶液；所述汞离子标准溶液为汞离子溶解于0.01 mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）得到的系列浓度溶液；所述洗液浓缩液为0.1 mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液，其中含0.05%的Tween-20（PBST）；所述样品处理液为0.1 mol/L的乙二胺四乙酸（EDTA）溶液；用于制备所述酶标板的固相材料为聚苯乙烯、聚乙烯或聚丙烯。 

所述的汞离子包被抗原是由以下方法制备的： 

（1）称取20 mg 卵清蛋白（OVA）溶于1 mL浓度为0.01 mol/L、pH值为9.0的HEPES缓冲液中，形成载体蛋白溶液；