[发明专利]爆裂玉米幼胚愈伤组织诱导和植株再生的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种玉米培育方法，具体涉及爆裂玉米幼胚愈伤组织诱导和植株再生的方法。

背景技术

目前，随着玉米自交系B73大规模测序的完成，克隆了很多有用基因，加之基因工程技术手段的不断发展和日趋完善，为转基因育种打下了良好的基础。自从1984年第一株转基因植株的获得，世界开展了对转基因技术的各项研究，同时也对玉米进行性状改良和基因功能的研究。玉米遗传转化已是国内外的研究热点之一。

要做转基因的相关研究就要有优良的转化体系，当今世界对普通玉米的转化体系已研究甚多，尤其是利用杂交种HiII的转化研究，但转基因后代需要进行多代的回交来纯化遗传背景，才能得到研究者所需要的转基因材料。近年来，研究者们也致力于研究玉米自交系的再生体系。2011年，田风龙对玉米自交系齐319、昌7-2、18-599和178的幼胚诱导愈伤，然后用农杆菌侵染的方法得到了DWF4的转基因植株。2011年，季丽丽等以922、H99、丹598和丹988四个玉米自交系为材料，优化了幼胚愈伤组织的诱导调节。2009年，陶芳等分别用法059、4K060、4K061、4K261、4K2965个高油玉米自交系的幼胚建立并优化了其再生体系。2007年，侯丽红分别用高油玉米自交系GY220、GY246、GY302、GY798和GY923的幼胚建立了其再生体系。2004年，胡建广等以超甜玉米自交系S1 、S2 、S3 和粤甜3 号等幼胚为试验材料，建立其高效成株系统。2007年，梁雪莲等以香白糯玉米幼胚为实验材料，建立其再生体系，并以农杆菌介导的方法成功得到了cpTI和Bar基因的转化植株。而对爆裂玉米再生体系及其遗传转化的研究至今还是空白。爆裂玉米自交系遗传转化的研究具有颇多优点。首先，与普通玉米相比，爆裂玉米生育期较短；其次，与普通玉米相比，爆裂玉米植株小，各植株性状均具有显著差异；且其籽粒小，便于观察具有差异的表现型。若研究的相关基因是控制植株性状、籽粒大小、产量等方面的，以爆裂玉米为受体进行遗传转化，通过对后代各性状的调查，可以很容易得到表现型的相关数据，进而可实现对相关基因的深层次研究。再次，以爆裂玉米自交系为受体的遗传转化，筛选所得T1代阳性植株即有表现型，不需要再进行多次回交纯化遗传背景，即可在早代进行分析比较，省时省力。最后，爆裂玉米本身就具有较高的营养价值，通过遗传转化来实现高产，也是一个重要的研究方向。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种爆裂玉米幼胚愈伤组织诱导和植株再生的方法。

本发明的技术方案是：爆裂玉米幼胚愈伤组织诱导和植株再生的方法，先将玉米自交系幼胚诱导出愈伤，经两次继代，选取其中玉米胚型愈伤组织，直接再生成完整植株，所述玉米自交系为N10或N04，它的步骤如下：

（1）取人工自交授粉后10-11天的玉米幼穗灭菌处理后，在超净工作台中拨取幼胚，胚轴朝下放在诱导培养基上，诱导出第一次玉米愈伤组织；

（2）由步骤（1）得到的第一次玉米愈伤组织切去胚芽转移到新的诱导培养基上，15天后得到第二次玉米愈伤组织；

（3）由步骤（2）得到的第二次玉米愈伤组织夹碎后转移到新的诱导培养基上，每隔15天继代一次，继代两次，得到玉米胚型愈伤组织；

（4）由步骤（3）得到的玉米胚型愈伤组织转移到分化培养基上得到玉米丛生苗；

（5）将步骤（4）得到的玉米丛生苗分成单个苗，转入生根培养基中再生成完整植株。

所述步骤（1）、步骤（2）、步骤（3）中N04的诱导培养基是：MS基本培养基4 g/L  +N6维生素（1000x）1ml + 2,4-D  0.4 mg/L + L-脯氨酸5 g/L + 蔗糖30 g/L + 肌醇0.1 g/L + 水解酪蛋白0.1 g/L + AgNO₃  36μM/L + 植物凝胶3 g/L，pH为5.8。

所述步骤（1）、步骤（2）、步骤（3）中N10的诱导培养基是：MS基本培养基4 g/L +N6维生素（1000x）1ml + 2,4-D 2 mg/L + L-脯氨酸2.76 g/L + 蔗糖30 g/L + 肌醇0.1 g/L + 水解酪蛋白0.1 g/L + AgNO₃  13 μM/L + 植物凝胶3 g/L，pH为5.8。

所述步骤（4）中的分化培养基是：MS基本培养基4 g/L + 肌醇0.1 g/L + 蔗糖30 g/L + 6-BA  0.2 mg/L + 植物凝胶3 g/L，pH为5.8。