[发明专利]一种减少L-丝氨酸生产菌株谷氨酸棒杆菌SYPS-062代谢副产物的方法

说明书

技术领域

 本发明涉及一种减少L-丝氨酸生产菌株谷氨酸棒杆菌SYPS-062代谢副产物的方法及其应用，属于工业生物技术领域。

背景技术

[0002] L-丝氨酸，化学名为α-氨基-β-羟基丙酸，分子式为C₃H₇NO₃，分子量105.10。L-丝氨酸属于非必需氨基酸，具有许多重要的生理功能，在医药、食品、化妆品等领域具有较为广泛的应用。

L-丝氨酸是一种瓶颈氨基酸，近年来，虽然有很多关于L-丝氨酸生产方法的研究报告，但迄今为止尚缺乏较为经济、有效的工业化生产方法，我国至今没有实现产业化，产品需求主要依赖进口。2010年我国丝氨酸市场需求量为350吨，其中国内生产的20％基本采用水解天然蛋白质的方法，该方法操作费时，收率和产量低，成本高，不适合大规模的生产，同时存在较为严重的污染问题。因此，研究和开发发酵法生产L-丝氨酸的新菌种、新工艺对于打破日本等国长期以来在L-精氨酸等品种上的垄断具有十分重要的意义，也将进一步提升我国发酵法生产氨基酸的整体技术水平，完善我国氨基酸工业，调整药用氨基酸的产品结构，满足国内药用氨基酸市场需求。

目前，国内外生产L-丝氨酸的方法主要有化学合成法、蚕丝水解法、酶法、前体发酵法等生物法，但是利用糖质原料通过直接发酵法生产L-丝氨酸的报道较少。其中以甘氨酸为前体经丝氨酸羟甲基转移酶催化生产L-丝氨酸生产技术己经工业化，最近又开发了采用具有高活丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)的甲醇同化菌由甘氨酸生产L-丝氨酸的方法，日本主要以甘氨酸为前体发酵生产L-丝氨酸，但前体物价格昂贵，生产成本高。国内主要以蚕丝水解法生产L-丝氨酸，即将废蚕丝、蚕蛹、丝胶水解，以提取L-丝氨酸；此法操作复杂，需处理大量的洗脱液，所得的氨基酸常为混合氨基酸，还需进一步分离、精制，不适合大规模的生产。因此，由于生产技术难度高，生产成本大，价格居高不下，严重限制了L-丝氨酸的应用。

为了能够获得L-丝氨酸的高效生产菌株和简化下游产物的分离纯化工艺，在构建高产菌株的时候需要除了需要提高菌株目标产物生物合成途径的效率，还需考虑尽可能地减少代谢副产物的积累。谷氨酸棒杆菌是氨基酸生产的重要菌株，现已用于L-谷氨酸、L-赖氨酸和L-苏氨酸的氨基酸的工业化生产。江南大学药学院制药工程实验室从土壤中筛选到一株能够利用糖质原料发酵生产L-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌SYPS-062，通过随机诱变筛选和代谢工程改造获得的重组菌株能够利用蔗糖发酵大量积累L-丝氨酸，但是发酵液中还存在有L-丙氨酸和L-缬氨酸两种代谢副产物。

谷氨酸棒杆菌中L-丝氨酸、L-丙氨酸和L-缬氨酸三种氨基酸是以丙酮酸为中心代谢物形成代谢物三角，见图1。L-丝氨酸通过L-丝氨酸脱氨催化其脱水脱氨生成丙酮酸，另外两种副产物L-丙氨酸和L-缬氨酸均是以丙酮酸为前体物质生物合成而来。L-丝氨酸向丙酮酸转化，一个方面是使得目标产物产量降低，产物丙酮酸积累会影响菌体生理特性的同时增加发酵液中L-丙氨酸和L-缬氨酸在的含量，两种氨基酸的积累不仅造成碳骨架和氮源的大量流失浪费，而且会增加下游产物的分离提取工艺的复杂性和影响中产物的纯度。

发明内容

本发明根据谷氨酸棒杆菌SYPS-062△S利用糖质原料发酵生产L-丝氨酸的同时，发酵液中积累L-丙氨酸和L-缬氨酸两种代谢副产物。本发明的目的在于，采用基因工程手段将催化相关代谢反应的酶编码基因在基因组水平实现敲除，减少通过L-丝氨酸脱氨酶（L-serine deaminase）催化L-丝氨酸向丙酮酸转化，以及丙酮酸生物合成L-丙氨酸和Ｌ-缬氨酸的能力，提高主产物L-丝氨酸积累的同时降低副产物L-丙氨酸和L-缬氨酸的合成能力。

选择将L-丝氨酸脱氨酶（L-serine deaminase）的编码基因sdaA，以及L-丙氨酸和L-缬氨酸生物合成途径中的转氨酶编码基因alaT和ilvE在谷氨酸棒杆菌SYPS-062△S基因组顺序敲除，最终构建一株sdaA, alaT和ilvE共敲除的重组菌株谷氨酸棒杆菌SYPS-062△S-Ⅲ。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

分别按照如下实验方案分别将sdaA, alaT和ilvE三个基因在基因组敲除，最终构建获得三重基因缺失的重组菌株谷氨酸棒杆菌SYPS-062△S-Ⅲ，具体构建过程如下：