[发明专利]用于检测HBV拉米夫定和/或阿德福韦耐药性的多重连接探针实时荧光PCR试剂盒

权利要求书

1.用于检测HBV拉米夫定和/或阿德福韦耐药性的多重连接探针实时荧光PCR试剂盒，所述多重连接探针实时荧光PCR试剂盒包括:MLPA探针组、填充序列和通用引物组成，其特征在于：所述MLPA探针组分别是针对HBV的P基因逆转录区的rtM204V和/或rtM204I和/或rtA181T和/或rtA181V和/或rtN236T位点而设计的特异性序列。

2.根据权利要求1所述的用于检测HBV拉米夫定和/或阿德福韦耐药性的多重连接探针实时荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述MLPA探针组共有1～5组，包括MLPA探针组Ⅰ和/或MLPA探针组Ⅱ和/或MLPA探针组Ⅲ和/或MLPA探针组Ⅳ和/或MLPA探针组Ⅴ；所述MLPA探针组Ⅰ分为如SEQ ID NO:1所示的5’探针和如SEQ ID NO:2所示的3’探针，所述MLPA探针组Ⅱ分为如SEQ ID NO:3所示的5’探针和如SEQ ID NO:4所示的3’探针，所述MLPA探针组Ⅲ分为如SEQ ID NO:5所示的5’探针和如SEQ ID NO:6所示的3’探针，所述MLPA探针组Ⅳ分为如SEQ ID NO:7所示的5’探针和如SEQ ID NO:8所示的3’探针，所述MLPA探针组Ⅴ分为如SEQ ID NO:9所示的5’探针和如SEQ ID NO:10所示的3’探针。

3.根据权利要求2所述的用于检测HBV拉米夫定和/或阿德福韦耐药性的多重连接探针实时荧光PCR试剂盒，其特征在于：将如SEQ ID NO:5所示的5’探针设置错配，其核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示；和/或将如SEQ ID NO:7所示的5’探针设置错配，其核苷酸序列如SEQ ID NO:29所示。

4.根据权利要求2所述的用于检测HBV拉米夫定和/或阿德福韦耐药性的多重连接探针实时荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述通用引物中，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。

5.根据权利要求2所述的用于检测HBV拉米夫定和/或阿德福韦耐药性的多重连接探针实时荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述填充序列为Taqman探针序列，如SEQ ID NO:13-17任一所示。

6.用于检测HBV的P基因的探针，其特征在于：所述MLPA探针有1-5组，分别是针对HBV的P基因逆转录区的rtM204V和/或rtM204I和/或rtA181T和/或rtA181V和/或rtN236T位点而设计的特异性序列，其中rtM204V位点的特异性序列如SEQ ID NO:18-19任一所示，rtM204I位点的特异性序列如SEQ ID NO:20-21任一所示，rtA181T位点的特异性序列如SEQ ID NO:22-23任一所示，rtA181V位点的特异性序列如SEQ ID NO:24-25任一所示，rtN236T位点的特异性序列如SEQ ID NO:26-27任一所示。

7.根据权利要求6所述的多重连接探针实时荧光PCR试剂盒的使用方法，具体包括以下步骤：

A检测前样本预扩增

提取待测样本的HBV基因组，利用DNA聚合酶扩增出P基因逆转录区片段作为靶序列，所述P基因逆转录区片段覆盖被检测的突变位点；

B杂交反应和连接反应

每组MLPA探针组中的3’探针和5’探针与步骤A所得的靶序列杂交反应后，在DNA连接酶的作用下，凭借磷酸二酯键将所述MLPA探针组中的一对探针连接成单链DNA探针；

C实时荧光PCR

加入标记荧光素的TaqMan探针，用所述通用引物扩增步骤B所得单链DNA探针，采集荧光信号强度，并读数和分析。

8.根据权利要求7所述的使用方法，其特征在于：所述的使用方法，步骤B和C中，设置有实验组、阴性对照组、阳性对照组和空白组，所述阴性对照组为HBV阳性的野生型，阳性对照组为各突变型。

9.据权利要求8所述的使用方法，其特征在于：所述的使用方法，步骤C中，SEQ ID NO:13被FAM荧光素标记，SEQ ID NO:14被HEX荧光素标记，SEQ ID NO:15被ROX荧光素标记，SEQ ID NO:16被CY5荧光素标记，SEQ ID NO:17被LC-red705荧光素标记。