[发明专利]一种通过缺失单个盐键来提高PAE比活力的方法

权利要求书

1.一种通过缺失单个盐键来提高PAE比活力的方法，其特征在于，PAE中残基正负电荷间距离小于4 ??，不考虑His形成的盐键之外含有6个盐键，盐键1-3位于催化腔附近，盐键4-6位于C端结构域的C末端，将形成盐键2的Asp189-Arg179中的Asp189进行定点突变，提高PAE比活力。

2. 根据权利要求1所述的一种通过缺失单个盐键来提高PAE比活力的方法，其特征在于，将形成盐键2的Asp189-Arg179中的Asp189定点突变为Ala，构建突变体D189A。

3. 根据权利要求2所述的一种通过缺失单个盐键来提高PAE比活力的方法，其特征在于，突变体D189A的引物：

两端引物：

正向引物：GCTTGGACCATATGAAGAAGGTTTCTACGCTTGACC，划横线部分表示Nde I酶切位点；

反向引物：CGCGCTCGAGTTACAACGCGCTCGGGCAG，划横线部分表示Xho I酶切位点；

D189A中间引物：

3’ 端引物：TTCCTGATCGGCTACGCGATCAAGAAGGGCAGCG

5’ 端引物：GCCCTTCTTGATCGCGTAGCCGATCAGGAAGTCGTTC。

4.根据权利要求3所述的一种通过缺失单个盐键来提高PAE比活力的方法，其特征在于，突变体的原核表达为：

①以含Nde I酶切位点的正向引物和突变体中间引物的3’引物为两端引物，以lasB质粒为模板，扩增产物标为Ⅰ；以含Xho I酶切位点的反向引物和突变体中间引物的5’引物为两端引物，以lasB质粒为模板，扩增产物标为Ⅱ；

②回收Ⅰ和Ⅱ，通过PCR 反应程序，将Ⅰ基因和Ⅱ 基因相互融合；

③最后再加入两侧正、反向引物通过PCR反应程序，得到突变体基因。

5. 根据权利要求4所述的一种通过缺失单个盐键来提高PAE比活力的方法，其特征在于，有酶活突变体的筛选：

①利用琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，EB染色，切取目的片段大小的DNA，回收DNA；

②DNA用限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ酶切，连接同样酶切过的pET-22b表达载体；

③连接产物转化E. coli DH5α；

④从转化平板上挑取转化子至液体LB培养基中培养，利用提质粒酶切验证的方法筛选携带目的基因的转化子；

⑤将测序正确的含目的基因的质粒转化E. coli BL21(DE3)；

⑥从平板上挑取转化子单菌落到试管中，37??C 过夜培养后按1%接种量转接到三角瓶中，37??C 培养至OD₆₀₀ ＝1.0 左右加入终浓度1 mM 的IPTG 继续培养过夜；

⑦发酵液离心收集菌体，菌体用三蒸水洗涤3遍以上后用50 mM,pH 8.0的Tris-HCl 缓冲液重悬，超声破碎至菌液澄清，超声完毕后离心，上清在30??C 保温2 h；

⑧用Folin－酚法测粗酶液酶活。

6. 根据权利要求5所述的一种通过缺失单个盐键来提高PAE比活力的方法，其特征在于，步骤⑦发酵液离心收集菌体，超声破碎条件为：功率300 w，超声5 s，间隔10 s，超声10 次。