[发明专利]基因组减少的细菌

说明书

本申请是申请号为038025450的中国专利申请的分案申请，原申请是国际申请PCT/US2003/001800的中国国家阶段申请。

相关申请的交叉引用

本专利申请是提交于2002年1月23日的美国专利申请序列号10/057,582和提交于2002年9月6日的美国临时专利申请序列号60/409,080的后继部分，它们都全部纳入本文供参考。

关于联邦赞助研究或发展的声明

本发明得到美国政府支持进行，由下列机构授予：NIH GM35682。美国对此发明有一些权利。

技术领域

本发明涉及基因组减少的细菌。

背景技术

细菌用于生成广泛范围的商业产品。例如，许多链霉菌属(Streptomyces)菌株和杆菌属(Bacillus)菌株用于生成抗生素；脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)和许多丙酸菌属菌株用于生成维生素B12；一些其它细菌用于生成维生素核黄素；黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)和谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)分别用于生成赖氨酸和谷氨酸作为食物添加剂；其它细菌用于生成其它氨基酸作为食物添加剂；真养产碱菌(Alcaligenes eutrophas)用于生成可生物降解的微生物塑料；许多醋酸杆菌属(Acetobacter)和葡萄糖酸菌(Gluconobacter)菌株用于生成醋。近来，细菌如大肠杆菌(E.coli)更常被遗传改造和用作宿主细胞以在实验室以及工业设置中生成生物制剂，如蛋白质和核酸。制药业支持了一些成功产品的例子，它们是在发酵罐中培养的大肠杆菌培养物中产生的人类蛋白质。

正常细菌蛋白质不利影响所需蛋白产物从工程菌中生成或纯化不是不普遍。例如，当大肠杆菌用作宿主细胞以产生大量基因编码的所需产物，基因通过质粒导入宿主细胞，一些正常大肠杆菌基因产物可干扰质粒DNA的导入和维持。更重要的是，由于细菌产生蛋白质中的细菌培养经济，通常纯化重组蛋白的成本可大于生成成本，细菌宿主生成的一些天然蛋白质对于纯化问题敏感。此外，许多细菌菌株产生的毒素必须从正生成的靶蛋白中纯化出且一些菌株能同时产生大小与靶蛋白接近的天然蛋白质，从而使大小分离不能用于纯化过程。

然而同样，发酵罐中用于生成重组蛋白的细菌基因组包括许多不必需基因。在自然环境中生长的细菌有许多条件响应基因以提供机制在温度、压力或缺乏食物来源的困难环境条件中生存。发酵罐中生长的细菌没有这些问题并因而不需要这些条件响应基因。细菌宿主将各增殖循环的代谢能量用于复制这些基因。因此，用于生成重组蛋白的细菌宿主所产生的不必需基因和不需要蛋白导致系统缺乏效率，这可被改进。

使微生物基因组产生缺失不是很困难。可简单通过缺失基因组区域在生物体中进行随机缺失研究以确定生物体的什么特性由于缺失基因而失去。然而，基因组DNA特定区域进行靶缺失更困难，如果发明目标之一是缺失后不在生物体留下插入DNA更加困难，这里插入DNA定义为“瘢痕”。如果插入DNA即瘢痕区域在基因组缺失过程后留下，这些区域可作为不需要重组的位置，能切除所需或产生基因组重排的基因组区域。在确立一系列多种缺失时，前面步骤留下的瘢痕可作为随后缺失步骤的人工靶。当方法重复用于从基因组产生一系列缺失时更是如此。换句话说，如果留下插入DNA，生物体由于缺失过程变成遗传不稳定。

发明内容

本发明提供方法用于优选减少生物体基因组而不在基因组中留下瘢痕。

在一个实施方案中，本发明提供一种细菌，所具有的基因组被遗传改造成比其天然亲代菌株基因组小至少百分之二(2％)到百分之二十(20％)。基因组优选比其天然亲代基因组小至少百分之七(7％)。基因组更优选比其天然亲代菌株基因组小至少百分之十四(14％)到百分之二十(20％)。当用于生成产品时，具较小基因组的细菌可有一个或多个下列优势。第一，生产过程在资源消耗或生产速度、最终产生百分比或所有三个方面效率更高。第二，可简化产品纯化过程或能产生更纯的产物。第三，以前由于天然蛋白质干扰不能生成的产品可被制成。第四，所需产品的每细胞产量可增加。