[发明专利]肝祖细胞的条件培养基

说明书

本申请是国际申请日为2009年6月11日、国际申请号为PCT/EP2009/057232、进入国家阶段的申请号为200980131229.6、发明名称为“肝祖细胞的条件培养基”的PCT申请的分案申请。

本发明属于生物药用制品和再生医学的领域。

经证实，干细胞制品对人或动物组织发挥再生作用。测试生物人工肝支持物在治疗暴发性肝功能衰竭 (FHF)中的效能的临床试验，已经提供了一些有希望的结果，然而现有的装置尚未表现出对于常规用途而言足够的效能和可靠性，主要是由于缺乏在功能上稳定的人肝细胞来源(Kobayashi N, Okitsu T, Tanaka N. Cell choice for bioartificial livers. Keio J Med. 2003;52(3):151-7)。肝干细胞或甚至源自其它组织的干细胞，可以潜在地提供人肝细胞的替代来源。除了骨髓以外，干细胞存在于成体组织（诸如肝和中枢神经系统）中，且具有比以前已知的大很多的可塑性。

经证实，在国际专利申请WO2006/126236中所述的人肝多能祖/干细胞经历向多种组织细胞类型的分化，并发挥器官再生作用。这些细胞源自表达肝细胞标记物的非卵圆的人肝多能祖细胞系。

国际专利申请 WO2006/126236 还公开了分离上述能经历向多种细胞类型的分化的人肝多能祖/干细胞的方法，所述方法包括下述步骤:

(i)在细胞培养基中培养成体肝-衍生的人成熟肝细胞，直至成熟肝细胞死亡，并选择具有上皮样形态的存活细胞群；

(ii)通过在含血清、含葡萄糖、补加hEGF (人上皮生长因子)和bFGF (碱性成纤维细胞生长因子)并包含哺乳动物细胞生长必需的常见无机盐、氨基酸和维生素的培养基中培养，扩增具有上皮样形态的存活细胞群，

且特别地，其中在有冷冻保护剂存在下，在含血清的培养基中冷冻成熟肝细胞，然后在根据步骤(i) 培养之前解冻。

WO2006/126236的人多能祖细胞(在专利说明书中指定为HLSC)及其制备方法通过引用完整地并入本文。

经证实，间质干细胞(MSC)制品对组织发挥再生作用。例如，已知骨髓-衍生的间质干细胞通过分泌许多营养分子（包括可溶的胞外基质糖蛋白、细胞因子和生长因子）天然地支持血细胞生成。

但是，干细胞制品的主要缺点是，在施用时造成免疫反应。某些干细胞制品甚至具有造成癌症的可能性。

Parekkadan 等人 (Parekkadan B, van Poll D, Suganuma K, Carter EA, Berthiaume F, Tilles AW, Yarmush ML. Mesenchymal stem cell-derived molecules reverse fulminant hepatic failure. PLoS ONE. 2007 Sep 26;2(9):e941)首次评估了不同的MSC-治疗，诸如递送条件培养基(CM)，以测试它们在诱发严重肝损伤的大鼠模型中的效能。在该文章中，给大鼠腹膜内地施用共2次D-半乳糖胺 (Gal-N)注射。在第二个研究(Van Poll D, Parekkadan B, Cho CH, Berthiaume F, Nahmias Y, Tilles AW, Yarmush ML. Mesenchymal stem cell-derived molecules directly modulate hepatocellular death and regeneration in vitro and in vivo. Hepatology. 2008 Jan 24;47(5):1634-1643)中，Parekkadan的研究组研究了MSC-CM的全身输注是否会在急性损伤的肝中产生肝保护应答，具体地通过抑制细胞死亡和刺激修复程序。该研究组使用D-半乳糖胺诱导的亚致死方案，证实了在MSC-CM治疗后显著的存活益处和肝酶释放的阻止。

考虑到干细胞治疗的上述缺点，再生医学领域中现有的非常有效的制品通常含有细胞的事实，是应当克服的一个技术问题。

因而，本发明的目的是，提供这样的制品，其可有效地用作再生医学领域中的药物组合物，但是其不含有细胞，从而避免含有细胞、尤其是干细胞的现有制品所造成的缺陷。

本发明的另一个目的是，提供制备药物组合物的方法，所述药物组合物在再生医学领域中是有效的，但是其不含有细胞，从而避免含有细胞、尤其是干细胞的现有制品所造成的缺陷。