[发明专利]一种利用Hoechst33342对猪囊胚进行简易荧光计数的方法

说明书

技术领域

本发明属于胚胎生物学领域，具体涉及利用Hoechst33342对猪囊胚进行简易荧光计数的方法。

背景技术

胚胎细胞数目作为反应胚胎细胞质量的一个重要客观指标，对胚胎移植具有重要的作用。哺乳动物胚胎细胞计数常用方法有：空气晾干制片法、压片法、放射性同位素标记法和荧光染色法等(孙兴参，1996)。由于荧光染色法的可靠、高效性，其应用最为广泛。目前国际上较为通用的囊胚荧光细胞计数方法为Hoechst33342染色法，但流程上有很大的差异，从而造成了染色效果的显著不同。目前见到的Hoechst33342荧光染色方法有以下几种：

1、直接将囊胚置于荧光染色液中染色后压片观察(Zhu，Telfer et al.2002；Im，Lai et al.2004：SUGIMURA，YAMANAKA et al.2010；Yuan and Krisher2010)；

2、先将囊胚固定，常采用多聚甲醛，后进行染色压片观察(Long，Dobrinsky et al.1999；李秋艳.2010)；

3、将囊胚放入甘油中脱水、固定后染色压片观察(Du，Kragh et al.2007)。

上述方法存在着明显问题：对于第1种，直接染色后压片，由于囊胚细胞内含有大量水分，压力会造成细胞膜破裂，从而无法清晰区分细胞界限，造成计数困难；对于第2种多聚甲醛固定，虽然可使细胞内蛋白质变性，细胞骨架保持原始形态，但由于细胞内水分未脱出，细胞内存在大量未填充空间，从而造成压片后很难压出囊胚原始形态；对于第3种，甘油同时具有脱水和固定双重作用，但无法将细胞内水完全脱去，同时其对蛋白质变性作用较弱，所以染色后也会造成一定程度的囊胚细胞破裂，从而无法压出其原始形态。

发明内容

本发明的目的在于公开了一种简单、实用的利用Hoechst33342对猪囊胚进行简易荧光计数的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种利用Hoechst33342对猪囊胚进行简易荧光计数的方法，包括以下步骤：

(1)、先将猪囊胚于DPBS液中洗涤干净，后放于DT液中透化；

(2)、将步骤(1)中透化完成后的猪囊胚放于EH液中，在脱水固定后进行染色；其中EH液中Hoechst33342浓度为45μg/ml；

(3)、将步骤(2)中染色后的的猪囊胚置于甘油，用石蜡-凡士林封片，荧光观察并计数；

所述DT液是将99ml DPBS加入0.01g PVA混匀，加入1ml Triton X-100，摇床200rpm，30min，0.22μm滤器过滤所得；

EH液的制备过程为：先将1mg Hoechst33342加入1ml DPBS中，0.22μm滤器过滤后得到母液；然后将9.55ml无水乙醇加入450μL H母液，0.22μm滤器过滤得到EH液。

根据上述技术方案所述的方法，其中，步骤(1)中放于DT液中透化的时间为10s-5min。

根据上述技术方案所述的方法，其中，步骤(2)中透化完成后的猪囊胚放于EH液中，在4℃下脱水固定后染色过夜，其中脱水固定的时间为6h-12h；盛放EH液的容器封口、避光。

根据上述技术方案所述的方法，其中，步骤(3)的具体过程为：将经步骤(2)处理的猪囊胚置于甘油中；取出载玻片，吸取单个囊胚置于载玻片中间，每个囊胚带有10～20μl甘油；取盖玻片用石蜡-凡士林做柱封片。

本发明具有以下有益效果：

(1)、采用本发明所提供的方法，染色压片后可以很好保持囊胚细胞原始形态，细胞与细胞间界限清晰，可以准确对猪囊胚进行计数。

(2)、本发明所述的方法此方法操作简单，基本每一枚囊胚都能很好进行染色，降低宝贵囊胚消耗。

(3)、本发明所述的方法所需试剂及器材简单，适用于大部分胚胎生物学实验室，若做成试剂盒使用，可明显提高实验室囊胚质量评定效率。

附图说明：

1、图1为采用Zhu，J.，E.E.Telfer，et al.(2002).″Improvement of an electrical activation protocol for porcine oocytes.″Biology of reproduction66(3)：635-641.文献中染色法得到的荧光图效果图；