[发明专利]猪瘟兔化弱毒疫苗荧光定量RT-PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明所涉及的猪瘟兔化弱毒疫苗荧光定量RT-PCR检测试剂盒，属于兽医微生物学领域动物病毒学技术。 

背景技术

猪瘟（Classical Swine Fever，CSF)是由猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus，CSFV）引起的高度接触性、致死性传染病。根据OIE制定的《陆生动物卫生法典》第五版，CSF被列为必须报告的动物疫病之一，在中国被列为“一类动物疫病”。猪瘟兔化弱毒疫苗株（Hog Cholera Lapinized Virus，HCLV），简称“C”株（Chinese strain），是目前世界公认的最好的猪瘟活疫苗制苗毒株，在中国乃至国外许多国家防控猪瘟工作中起着重要的作用。目前，按照《中华人民共和国兽药典》三部2010年版，猪瘟兔化弱毒疫苗依然主要采用兔体定型热反应进行疫苗的效力检验，但由于试验动物的个体差异、环境因素及原材料等多方面原因，检测结果不是十分准确；兔体定型热试验还存在成本比较高，实验周期过长，用于检测的样本量不符合统计学标准等缺点，因此建立实用、标准化的疫苗效力检验替代方法势在必行。 

建立荧光定量RT-PCR对猪瘟兔化弱毒疫苗细胞苗的效价测定方面，已有探索性研究，陈玉栋等（陈玉栋,张楚瑜,邹俊煊,等.建立快速定量检测猪瘟兔化弱毒苗的荧光定量PCR技术.中国病毒学,2003,18(2):124-128.）建立了猪瘟兔化弱毒疫苗核酸定量检测的荧光PCR方法，并与兔体定型热反应进行了比较，结果两只兔子均产生定型热反应疫苗样品中HCLV含量为10⁶～10⁷个病毒粒/mL；一只有定型热一只没有的为10⁶个病毒粒/mL。蒋春燕等（蒋春燕.猪瘟病毒实时荧光定量PCR快速检测试剂盒的研制与应用.中国兽医药品监察所硕士学位论文,2006.）将CSFVFQ-PCR技木应用于HCLV疫苗细胞培养液半成品的效力检验，分别对3个批次，总共13收次的疫苗原液和5、10、15、20、25万倍稀释液，同时用兔体定型热反应和CSFVFQ-PCR进行检测，比较并确立两种实验结果之间的相关性，即两只兔子均为定型热反应的CT值范围为26.63～28.80;只有一只无定型热反应的CT值范围为28.29～30.72;两只兔子均无定型热反应的CT值范围为30.3～32.79，分析并证实了不同的兔体定型热反应与相应的CT值范围、病毒含量之间都存在着很好的相 关性。 

上述文献中设计的荧光定量PCR检测方法都是针对所有猪瘟病毒毒株，造成特异性、敏感性都有所降低，尚待需要在生产厂家进行足够数量的疫苗效力检测评价。本发明针对HCLV毒株，设计HCLV特异性的引物和MGB探针，建立一套检测疫苗核酸含量的HCLV荧光定量RT-PCR检测方法（HCLV-MGB-RT-PCR），并组装猪瘟兔化弱毒疫苗荧光定量RT-PCR检测试剂盒，为HCLV中间产品效力检验提供敏感、准确和快速的替代方法。 

发明内容

一、本发明的主要技术原理 

实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time Fluorogenetic Quantitative PCR,FQ-PCR)技术是20世纪90年代中期发展起来的一种新型核酸定量技术（Heid,C.A.,et al.,Real time quantitative PCR..Genome Res,1996.6(10):986-94.），该技术是通过始点定量和荧光检测系统实时监测累积荧光强度而实现的，它可以采用绝对定量和相对定量两种方式实现定量检测。 

FQ-PCR技术包括探针类和染料类两种（Wittwer,C.T.,et al.,Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification.Biotechniques,1997.22(1):130-1,134-8）。探针类是利用与模板特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，以TaqMan^TM技术为代表，常用的荧光基团是FAM，TET，VIC，HEX；染料类是应用一种能与双链DNA小沟结合的荧光染料，荧光信号强弱与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量，常用的是SYBR GreenI染料。实时荧光PCR技术常用的探针技术包括TaqMan^TM水解探针技术和TaqMan MGB探针技术。