[发明专利]一种快速区分稻曲病菌交配型的分子检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物保护领域，是一种快速区别稻曲病菌（Villosiclava virens）交配型的分子检测方法。

技术背景

真菌的交配型是控制其交配亲和性和有性繁殖的遗传基础，同宗配合的子囊真菌通常具有一个交配型基因座；而大多数异宗配合的丝状子囊真菌有一对高度异源的交配型基因座。在异宗配合子囊真菌中，异源的交配型基因座分别为MAT1-1和MAT1-2，其中MAT1-1基因座至少含有一个具有α-结构域的交配型基因mat1-1-1，而MAT1-2交配型基因座则至少含有一个具有高泳动蛋白家族（HMG）结构域的交配型基因mat1-2-1，通过检测mat1-1-1和mat1-2-1交配型基因可确定异宗配合子囊真菌的交配型。

由稻曲病菌（有性态：Villosiclava virens；无性态：Ustilaginiodea virens）侵染引起的水稻稻曲病危害水稻穗部并产生毒素，严重影响稻米产量和品质。其在侵染后期可产生菌核，在田间越冬后于次年侵染适期可萌发进行有性繁殖产生子囊孢子，成为稻曲病的主要初侵染源。最新研究显示，稻曲病菌是异宗配合真菌，具有MAT1-1和MAT1-2两种交配型，含有MAT1-1和MAT1-2交配型稻曲病菌的菌核越冬后可萌发并产生子囊孢子；而仅含有MAT1-1交配型稻曲病菌的菌核不能萌发产生子座及子囊孢子。因此，田间可育菌核是稻曲病流行的关键因子之一，田间可育菌核数量的统计是建立病害流行预警体系的关键基础。

申请人在前期研究中根据Yokoyama等扩增到的稻曲病菌mat1-2-1 基因部分序列(Genbank 登录号:AB124632)和使用简并引物扩增到的稻曲病菌交配型基因mat1-1-1部分DNA序列（Genbank登录号：JQ844754），设计了两对特异性引物可用于检测稻曲病菌的交配型（植物病理学报，2012，42（6）：561-568），缩短了稻曲病菌交配型检测的周期，但该方法需要将一个稻曲病菌DNA样本进行两次PCR扩增和凝胶电泳，在检测大批量样本时操作较为繁琐。

通过多重PCR扩增体系对稻曲病菌DNA样本进行交配型检测，目前未见报道。该方法可快速检测稻曲病菌分生孢子单孢菌株、子囊孢子单孢菌株和菌核的交配型，适用于稻曲病流行预测及植物病理学领域的科学研究。

发明内容

本发明的目的在于：针对目前对稻曲病菌交配型检测方法中必须通过两次PCR扩增，检测步骤相对繁琐的缺陷，本发明提供一种更快速、且易于操作的检测稻曲病菌交配型的分子检测方法。

本发明的目的是这样实现的：一种快速区分稻曲病菌（Villosiclava virens）交配型的分子检测方法，包括收集待检菌丝和组织样品，采用CTAB法提取所需检测样本的基因组DNA，用0.7%的琼脂糖凝胶电泳进行分析，多重PCR扩增，使用凝胶成像系统记录电泳结果，利用标记判断DNA片段的大小，其特征在于，检测样本为：稻曲病菌分生孢子单孢菌株或子囊孢子单孢菌株或含有稻曲病菌的菌核，多重PCR扩增体系中涉及的两对扩增引物是Vm1-F/Vm1-R和Vm2-F/Vm2-R，其中，Vm1-F为SEQ ID NO.1，Vm1-R为SEQ ID NO.2，Vm2-F为SEQ ID NO.3，Vm2-R为SEQ ID NO.4。

在本发明中，多重PCR扩增体系为：取5uL不含Mg²⁺的10×PCR Buffer稀释10倍；浓度为25mM的MgCl₂，3μL；dNTP Mixture(2.5mM each)，4 μL；取浓度为1-5ng/μL模板DNA 1μL；引物Vm1-F和Vm1-R 以及引物Vm2-F和Vm2-R各1 μL；Taq DNA聚合酶，0.25μL；PCR扩增程序为：94°C，5min；35×（94°C，30s；65.4°C，30s；72°C，30s）；72°C，5min；4°C保存。