[发明专利]一种用于毕赤酵母表达重组人血清白蛋白的基因序列

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说涉及一种优化的用于毕赤酵母重组表达人血清白蛋白的基因序列和表达该基因的甲醇毕氏酵母工程菌。

背景技术

人血清白蛋白（HSA）在人体内重要的生理功能， 主要用于临床纠正因大手术、创伤、器官移植等引起的急性血容量减少；处理大面积烧伤、呼吸窘迫等引起的水、电解质和肢体平衡失调，以防止和控制休克；还用于急胃肠出血、肾透析以及严重的慢性疾患，如消化道吸收不良、肝硬变、肾病综合症、脑血管意外或脑局部缺血等内科疾病，特别是合并水肿的病例。人血白蛋白（HSA）还是生物制药必不可少的保护剂和赋形剂。

天然的HSA是由人类血浆提取的一类血液制剂药品，是现代医学用于预防和治疗不可缺少的药品，它是一类特殊的药品，其唯一原料是人血，一方面受社会、经济和政治因素的制约，不能随意开发，一方面是维系生命的重要物质，受原料短缺制约，临床应用受限，属于紧缺药品，另一方面由于血液难免被各种病原体感染，如：爱滋病毒、乙肝病毒、丙肝病毒等，血液制品的用药安全成为国际社会关注的突出问题。

基于以上来源和安全性的原因，利用基因重组技术大规模生产重组人血清白蛋白成为必然的选择。

由于HSA含有多个二硫键，采用原核系统很难得到正确折叠的表达产物；而使用哺乳细胞或昆虫细胞则在表达量和成本方面存在突出的问题，通常重组HSA的表达是采用较为低等的真核表达系统特别是用酵母的方式进行。如将在AOX1启动子控制下的HSA基因导入巴斯德毕赤酵母以得到转化细胞，得到可通过甲醇诱导的HSA表达工程株。有学者对毕赤酵母重组表达的HSA进行了比较实验，结果表明两者几乎完全相同。为了进一步提高HSA在酵母中的表达产率，有通过HSA编码序列进行修饰，通过改变基因结构以改进目标基因表达效率和水平的方法报道。如在98102506.4的中国发明专利提供的技术方案为：去除编码序列的内含子的剪接位点、非转录终止区的转录终止序列、长的重复序列、内部启动子序列及核糖体位点的修饰的基础上改造HSA基因密码子，使表达HSA的基因基本由酵母偏性密码子组成。

我们在HSA基因序列优化改改造研究中，综合考虑密码子的宿主偏性、基因GC含量、CpG含量、mRNA二级结构、序列的内含子的剪接位点、RNA结构不稳定序列、非转录终止区的转录终止序列、长的重复序列、等与基因表达效率相关的因素，设计了包括中国发明专利98102506.4中公开的基因序列在内的几个HSA序列优化方案。研究结果表明，将优化方案中的基因整合进腺苷合成缺陷型的PichiaPink毕赤酵母后都能表达HSA，但其中一个优化方案的序列对应的表达量不仅高于天然基因的表达量，也显著高于包括中国专利98102506.4中的公布序列在内的其他的优化方案的序列的表达量。此最佳方案的优化的基因序列与中国发明专利98102506.4的表达HSA的序列之间除了信号肽区不同外（前者为HSA信号肽，后者为α因子前原序列），在其他编码序列亦存在显著的区别。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能在腺苷合成缺陷型的PichiaPink毕赤酵母高效表达的人血清白蛋白（HSA）的基因序列。

本发明的另一个目的在于提供一种携带上述基因的PichiaPink工程重组菌株。

本发明的另一个目的在于利用上述PichiaPink工程重组菌株生产重组人血清白蛋白。

本发明所采取的技术方案是：

一种经优化的表达人血清白蛋白的基因，其具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

一种甲醇营养型的巴斯德毕赤酵母基因工程重组菌，其含有上述经优化的表达人血清白蛋白的基因。

所述的基因工程重组菌，其为Mut+表型的PichiaPink? 工程重组菌。

上述工程重组菌在生产重组人血清白蛋白中的应用。

一种克隆载体，其含有上述经优化的表达人血清白蛋白的基因。

一种表达载体，其含有上述经优化的表达人血清白蛋白的基因。起始载体可为pPink-LC载体、p-PINK-HC载体或其它可选用的高拷贝筛选用质粒。

一种甲醇营养型的巴斯德毕赤酵母基因工程重组菌，其含有上述的表达载体。

所述的基因工程重组菌，其为Mut+表型的PichiaPink? 工程重组菌。

上述的工程重组菌在生产重组人血清白蛋白中的应用。

本发明的有益效果是：本发明优化后的人血清白蛋白基因序列可在PichiaPink? 工程菌中实现人血清白蛋白的高效表达。

附图说明